Chương trình Vi sinh vật học

Dàn bài:

11- Phân loại xạ khuẩn

         Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces). Vì xạ khuẩn có cấu trúc nhân nguyên thuỷ như mọi vi khuẩn khác, chiều ngang của sợi cũng nhỏ như vi khuẩn, cho nên có tài liệu gọi chúng là nấm tia là không hợp lý. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai koại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores). Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores). Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử (như ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora, Micromonospora, Thermomonosspora...),có thể có 2 bào tử (như ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn  (như ở Nocardia, Pseudonocardia, Streptoverticillium, Sporichthya, Actinomadura, Microtetraspora, Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora, Microellobosporia...), có thể là chuỗi dài (như ở Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, nhiều loài ở Nocardia, Nocardioides, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Streptoverticillium...), có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (như ở Actinosynnema, Actinomadura...). Các chuỗi bào tử có thể thẳng, có thể xoắn, có thể ở dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng... Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ, có thể phân nhánh. Các đặc điểm hình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn.

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử. Thậm chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành túi bào tử như chi Streptosporangium, Micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia.

Trước đây, vị trí phân loại của Xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học ,do nó có những đặc điểm vừa giống Vi khuẩn vừa  giống Nấm. Tuy nhiên, đến nay, Xạ khuẩn đã được chứng minh là Vi khuẩn với những bằng chứng sau đây:

1.     Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.

2.     Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.

3.     Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn. Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn.

4.     Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.

5.     Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen.

6.     Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose.

7.     Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường, đặc điểm này không có ở nấm.

8.     Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín(sporangium) của chi Actinoplanes cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp.

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.

Hình của David A. Hopwood, John Innes Centre, U.K.
 

   Khuẩn lạc xạ khuẩn

Khuẩn ty xạ khuẩn và bào tử

Chuỗi bào tử trên cuống sinh bào tử dạng xoắn

  Bào tử xạ khuẩn

Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn nẩy mầm

Sợi bào tử và chuỗi bào tử trần

Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn (SV tự chú thích từng hình)

Một số dạng nang bào và nang bào tử ở xạ khuẩn

Một số dạng chuỗi bào tử ở xạ khuẩn (SV tự chú thích từng hình)

Đặc điểm của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất được trình bày trong sơ đồ sau đây:

Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.

Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo và tỷ lệ GC trong ADN.

Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes.

Thành tế bào: Theo Lechevalier và Lechevalier, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 8 loại dựa trên các đặc điểm về thành phần acid amin, đặc biệt là acid diaminopimelic, lysine và thành phần đường trong thành tế bào, cụ thể là

Tất cả các loại thành tế bào đều chứa alanine, acid glutamic, glucosamine và acid muramic.

 A₂pm: Acid diamino pimelic có thể gồm các đồng phân quang học LL- A₂pm, DL- A₂pm (meso- A₂pm), DD- A₂pm. Ngoài ra còn có OH- A₂pm khi có thêm nhóm OH gắn vào vị trí C thứ 4.

Lys: Lysine

Orn: Ornitin

A₂bu: acid diamino butyric

Gly: glycin

*Glycin nằm trong mối liên kết giữa hai mạch tetrapeptid

** Glycin thay thế L- alanin ở vị trí đầu tiên trong mạch tetrapeptid

Asp: Asparagin

Ara: Arabinose

Gal: Galactose

*** Trong xạ khuẩn chứa acid mycolic như Nocardia và Mycobacterium, thành tế bào chứa arabinogalactan, là hợp chất được tổng hợp từ arabinose và galactose.

Thành phần đường:

Peptidoglycan: Theo Schleifer và Kandler (1972), peptidoglycan ở xạ khuẩn được chia thành các nhóm như sau:

Dấu phẩy (‘): alanine ở vị trí thứ nhất trong mạch tetrapeptid đã được thay thế bởi glycine.

Ví dụ: Loại peptidoglycan của chi Actinoplanes là A1γ’có nghĩa là: Hai mạch tetrapeptid liên kết với nhau ở vị trí acid amin số 3 và 4, mối liên kết này là trực tiếp và acid amin ở vị trí số 3 là meso- A₂pm.

         Thành phần acid béo:

(v): ít hơn 5%

Thành phần menaquinone:

 Xạ khuẩn chỉ chứa menaquinone, không chứa ubiquinone. Ký hiệu 8(H­₂) hay MK-8(H₂) chỉ menaquinone chứa một trong số tám đơn vị isoprene bị hydro hóa.

Thành phần phospholipid:

Tất cả các loại đều chứa photphatidylinositol

Vị trí phân loại của Xạ khuẩn:

Lớp Actinobacteria

Dưới lớp Actinobacteridae      

         Bộ Actinomycetales

                   Dưới bộ Actinomycineae

                            Họ Actinomycetaceae

Các chi: Actinomyces, Actinobaculum, Arcanobacterium, Mobiluncus

                   Dưới bộ Micrococcineae

                            Họ Micrococcaceae

Các chi: Micrococcus, Arthrobacter, Kocuria, Nesterenkonia, Renibacterium, Rothia

                            Họ Bogoriellaceae

                                      Chi: Bogoriella

                            Họ Brevibacteriaceae

                                      Chi: Brevibacterium

                            Họ Cellulomonadaceae

                                      Chi: Cellulomonas

                            Họ Dermabacteraceae

                                      Các chi: Dermabacter, Brachybacterium

                            Họ Dermacoccaceae

                                      Các chi: Dermacoccus, Demetria, Kytococcus

                            Họ Dermatophilaceae

                                      Chi: Dermatophilus

                            Họ Intrasporangiaceae

Các chi: Intrasporangium, Janibacter, Terrabacter, Terracoccus, Tetraphaera       

                            Họ Jonesiaceae   

                                      Chi: Jonesia

                            Họ Microbacteriaceae

Các chi: Microbacterium, Agrococcus, Agromyces, Clavibacter, Cryobacterium, Curtobacterium, Frigoribacterium, Leifsonia, Leucobacter, Rathayibacter

                            Họ Promicromonosporaceae

                                      Chi: Promicromonospora

                            Họ Rarobacteraceae

                                      Chi: Rarobacter

                            Họ Sanguibacteraceae

                                      Chi: Sanguibacter

                            Incertae sedis (chưa xác định)

                                     Các chi : Beutenbergia, Ornithinicoccus, Kineococcus

                   Dưới bộ Corynebacterineae

                            Họ Corynebacteriaceae

                                      Các chi: Corynebacterium, Turicella

                            Họ Dietziaceae

                                      Chi: Dietzia

                            Họ Gordoniaceae

                                      Chi: Gordonia

                            Họ Mycobacteriaceae

                                      Chi: Mycobacterium

                            Họ Nocardiaceae

                                      Các chi: Nocardia, Rhodococcus

                            Họ Tsukamurellaceae

                                      Chi: Tsukamurella

                            Incertae sedis (chưa xác định)

                                      Các chi : Skermania, Williamsia

                   Dưới bộ Micromonosporineae

                            Họ Micromonosporaceae

Các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Catellatospora, Catenuloplanes, Couchioplanes, Dactylosporangium, Pilimelia, Spirilliplanes, Verrucosispora

                   Dưới bộ Propionibacterineae

                            Họ Propionibacteriaceae

Các chi: Propionibacterium, Friedmaniella, Luteococcus, Microlunatus, Propioniferax, Tessaracoccus

                            Họ Nocardioidaceae

Các chi: Nocardioides, Aeromicrobium, Hongia, Kribbella, Marmoricola

                   Dưới bộ Pseudonocardineae

                            Họ Pseudonocardiaceae

Các chi: Pseudonocardia, Actinobispora, Actinopolyspora, Amycolatopsis, Kibdelosporangium, Prauserella, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Thermocrispum

                            Họ Actinosynnemataceae

                                      Các chi: Actinosynnema, Actinokineospora, Saccharothrix

                            Incertae sedis (chưa xác định)

                                     Các chi: Kutzneria, Streptoalloteichus

                   Dưới bộ Streptosporangineae

                            Họ Streptosporangiaceae

Các chi: Streptosporangium, Acrocarpospora, Herbidospora, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Planomonospora, Planotetraspora

                            Họ Nocardiopsaceae

                                      Các chi: Nocardiopsis, Thermobifida

                            Họ Thermomonosporaceae

Các chi: Thermomonospora, Actinocorallia, Actinomadura, Spirillospora

                   Dưới bộ Glycomycineae

                            Họ Glycomycetaceae

                                      Chi: Glycomyces

                   Dưới bộ Streptomycineae

                            Họ Streptomycetaceae

                                      Các chi: Streptomyces, Kitasatospora

                   Dưới bộ Frankineae

                            Họ Frankiaceae

                                      Chi: Frankia

                            Họ Acidothermaceae

                                      Chi: Acidothermus

                            Họ Geodermatophilaceae

                                      Các chi: Geodermatophilus, Blastococcus

                            Họ Microsphaeraceae

                                      Chi: Microsphaera

                            Họ Sporichthyaceae

                                      Chi: Sporichthya

                            Incertae sedis (chưa xác định)

                                      Chi: Cryptosporangium

         Bộ Bifidobacteriales

                            Họ Bifidobacteriaceae

                                      Các chi: Bifidobacterium, Gardnerella

Dưới lớp Acidimicrobidae

         Bộ Acidimicrobiales

                            Họ Acidimicrobiaceae

                                      Chi: Acidimicrobium

Dưới lớp Coriobacteridae

         Bộ Coriobacteriales

                            Họ Coriabacteriaceae

Các chi: Coriobacter, Atopobium, Collinsella, Cryptobacterium, Denitrobacterium, Eggerthella, Slackia

Dưới lớp Rubrobacteridae

         Bộ Rubrobacteriales

                            Họ Rubrobacteriaceae

                                      Chi: Rubrobacter

Dưới lớp Sphaerobacteridae

         Bộ Sphaerobacteriales

                            Họ Sphaerobacteriaceae

                                      Chi: Sphaerobacter

Mô tả một số chi thường gặp:

Chi Rhodococcus:

Phát triển dưới dạng que hoặc khuẩn ty cơ chất phân nhánh. Ở tất cả các chủng, chu trình sống (morphogenetic) đều bắt nguồn từ giai đoạn hình cầu hoặc que ngắn. Bằng cách phân đoạn, các tế bào hình cầu sẽ tạo thành dạng que rồi dạng sợi, sợi phân nhánh và hệ sợi. Một số chủng còn tạo khuẩn ty khí sinh phân nhánh hoặc bó sợi (synnemata). Chúng không có khả năng chuyển động cũng như không hình thành bào tử hay nội bào tử.

Gram dương. Acid-alcohol fast (nhuộm kháng acid-cồn) ở một số giai đoạn phát triển. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hầu hết các chủng đều mọc tốt trên các môi trường tiêu chuẩn ở 30­^oC, số khác cần thiamin cho sinh trưởng. Khuẩn lạc có thể sần sùi hoặc trơn nhẵn, có màu vàng sẫm, kem, vàng, vàng da cam, đỏ hoặc không màu. Arylsulfatase âm tính, nhạy cảm với lysozyme, không phân hủy được casein, cellulose, chitin, elastin hay xylan. Có thể sử dụng được rất nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng.

Thành tế bào chứa lượng lớn acid meso- diaminopimelic (meso-DAP), arabinose và galactose. Chứa diphotphatidylglycerol, photphatidylethanolamin, photphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H­₂) và MK-9(H­₂). Chứa lượng lớn acid tuberculostearic mạch thẳng, không bão hòa và acid mycolic với 32-66 cacbon, với nhiều nhất bốn liên kết đôi. Tỷ lệ mol G+C trong ADN là 63-72%.

Có nhiều trong đất và phân gia súc. Một số chủng gây bệnh cho người và động vật.

Loài chuẩn: Rhodococcus rhodochrous

Chi Nocardioides:

Sợi sơ cấp phân nhánh trên bề mặt, sau đó xâm nhập vàp trong thạch rồi đứt đoạn thành dạng que hay cầu hay không đều. Sợi khí sinh có thể thưa thớt, phân nhánh hoặc không sau đó cũng đứt thành những mẩu ngắn hoặc dạng que. Những mẩu này sẽ là nguồn gốc của những sợi mới. Không có tế bào di động. Khuẩn lạc nhão. Gram dương. Không nhuộm kháng acid ( Non-acid fast ). Catalase dương tính. Hiếu khí bắt buộc. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Mọc dễ dàng trên các môi trường tiêu chuẩn. Nhạy cảm với thực khuẩn thể đặc hiệu. Acid amin chính trong thành tế bào là L-DAP và glycine. Không chứa acid mycolic. Phospholipid chủ yếu là photphatidylglycerol và acylphotphatidlyglycerol. Acid béo chiếm ưu thế là 14-methylpentadecanoic. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H­₄). Tỷ lệ mol G+C trong ADN từ 66,1-72,7%. Có nhiều trong đất.

Loài chuẩn: Nocardioides albus

Chi Pseudonocardia:

Sợi khí sinh và sợi cơ chất đều sinh bào tử dạng chuỗi. Sợi phân đoạn, thường có dạng zich-zac với xu hướng phồng lên ở ngọn hoặc ở giữa. Sợi kéo dài bằng cách nảy chồi. Các đoạn sợi có chức năng của bào tử hoặc biến đổi thành bào tử. Thành sợi có hai lớp. Gram dương. Không có giai đoạn di động. Hiếu khí. Sinh trưởng trên nhiều loại môi trường hữu cơ hoặc tổng hợp. Ưa ấm hoặc ưa nhiệt.

Loài chuẩn: Pseudonocardia thermophila

Chi Saccharopolyspora:

Sợi cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh, đứt thành các đoạn dạng que với kích thước 1x5μm, chủ yếu ở những phần già hơn của khuẩn lạc. Khuẩn ty khí sinh phân đoạn tạo các chuỗi bào tử. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hiếu khí. Khuẩn lạc mỏng, nhô lên, hơi nhăn, sợi khí sinh ít, thường tạo thành chùm, chủ yếu ở những phần già. Có thể sử dụng nhiều loại chất hữu cơ như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, có thể phân giải adenine, kháng nhiều loại chất kháng sinh nhưng nhạy cảm với lysozym. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 77%.

Loài chuẩn: Saccharopolyspora hirsute

Chi Intrasporangium:

Sợi phân nhánh, có xu hướng đứt thành nhiều đoạn có kích thước và hình dáng khác nhau. Không bao giờ có sợi khí sinh. Các túi bào tử hình oval hay hình quả chanh được tạo thành ở giữa hoặc/và ở đầu sợi. Các bào tử không di động. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hiếu khí. Mọc tốt nhất ở 28-37^oC, không mọc được ở 45^oC. Sinh trưởng tốt hơn trên các môi trường chứa peptone và cao thịt. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 68,2%. Thành tế bào chứa L-DAP và glycine. Thành phần phospholipid chủ yếu là một loại phospholipid chứa glucosamin chưa biết. Thành phần acid béo chủ yếu là các acid béo mạch thẳng bão hòa và không bão hòa. Menaquinone chính là MK-8.

Loài chuẩn: Intrasporangium calvum

Chi Actinopolyspora:

Hệ sợi phân nhánh, hình thành rất nhiều sợi khí sinh có đường kính khoảng 1 μm. Sợi cơ chất hầu hết không đứt đoạn. Cuống sinh bào tử chứa 20 hoặc hơn bào tử dạng que ngắn hoặc dạng cầu với vỏ nhẵn hình thành trên sợi khí sinh theo chiều hướng gốc. Sợi cơ chất không sinh bào tử. Gram dương. Nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64,2%.

Loài chuẩn: Actinopolyspora halophila

Chi Saccharomonospora:

Chủ yếu sinh bào tử đơn trên sợi khí sinh. Bào tử không bền nhiệt, không có khả năng di động, được hình thành trên các cuống sinh bào tử đơn giản, không phân nhánh, dài ngắn khác nhau. Trên môi trường thạch, hệ sợi dinh dưỡng phân nhánh, bao phủ bởi lớp sợi khí sinh với các bào tử mọc dày đặc dọc trên các sợi. Sợi khí sinh ban đầu có màu trắng rồi chuyển thành xám xanh và xanh sẫm. Sắc tố xanh cũng có ở sợi dinh dưỡng và khuếch tán ra môi trường. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Chứa lượng lớn iso- và anteiso- acid béo, photphatidylethanolamin và MK-9(H₄). Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 35-50^oC, pH 7-10. Sinh catalase, deaminase và photphatase. Phân hủy được casein, gelatin, tinh bột. xylan và tyrosin. Đặc biệt có thể sử dụng glycerol làm nguồn cacbon.

Phân lập được trong đất, chất lắng cặn ở hồ, than bùn, thấy nhiều trong phân bón, phân compôt, và cỏ khô. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-74%.

Loài chuẩn: Saccharomonospora viridis

Chi Frankia:

Không sinh sợi khí sinh. Túi bào tử thường sinh trên cuống sinh bào tử. Bào tử không có khả năng di động với hình dạng không cố định, từ không màu đến màu đen. Trong điều kiện khó khăn như không có quá trình cố định đạm, các túi (vesicle) có thể được hình thành. Gram dương- hoặc Gram không cố định (variable). Hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Catalase dương tính. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Thường mọc rất chậm (thời gian giữa hai lần phân đôi tế bào là 1-7 ngày). Hầu hết các chủng đều có khả năng cố định nitơ không khí invitro và in planta. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, acid muramic, và glucosamine. Thành phần phospholipid gồm photphatidylinositiol mannoside, photphatidylinositol và diphotphatidylglycerol. Acid béo dạng thường, mạch thẳng, và không bão hòa. Thành phần đường gồm xylose, madurose hoặc fucose, hoặc chỉ gồm glucose hoặc galactose. Nhiều chủng gồm 2-O-methyl-D-mannose, hầu hết các chủng chứa rhamnose. Hầu hết cộng sinh với một số thực vật hạt kín nhất định, tạo các nốt sần trên rễ ở vật chủ thích hợp. Có thể tìm trong đất. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 66-71%.

Loài chuẩn: Frankia alni

Chi Actinoplanes:

Phát triển dưới dạng sợi phân nhánh, không đứt đoạn. Gram dương, nhưng một phần sợi dinh dưỡng có thể là Gram âm. Không nhuộm kháng acid. Rất ít sợi khí sinh hoặc không có. Tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống sinh bào tử hoặc không cuống, ít khi trong thạch. Dưới điều kiện nhất định, nhiều chủng có hệ sợi sắp xếp dạng que (palisade). Khi đó, túi bào tử chủ yếu được sinh ở đầu các sợi. Bào tử hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử,  được hình thành bằng cách đứt đoạn sợi bên trong túi bào tử trực tiếp hoặc sau vài lần phân nhánh. Sau khi ngâm trong nước, bào tử di động được giải phóng ra từ túi bào tử, trong một số trường hợp, khả năng di động xuất hiện sau khi bào tử được giải phóng. Bào tử di động chứa tiên mao cực. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa D-xylose và L-arabinose. Thành phần phospholipid chính là photphatidylethanolamin. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, ưa ấm hoặc ưa nhiệt vừa phải. Hầu hết các chủng đều không cần các nhân tố sinh trưởng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%.

Loài chuẩn: Actinoplanes philippinensis

Chi Pilimelia:

Túi bào tử được sinh ra trên bề mặt của cơ chất từ cuống sinh bào tử. Túi bào tử có hình cầu, hình trứng, hình quả lê, hình chuông hay hình trụ, có kích thước xấp xỉ 10-15 μm. Túi bào tử chứa rất nhiều bào tử xếp thành chuỗi song song hoặc các hàng cuộn không đều. Gram dương. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,2-0,8 μm, phân nhánh và có vách ngăn. Khuẩn ty khí sinh thật sự không được hình thành. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Chỉ mọc được trên môi trường hỗn hợp. Khuẩn lạc nhỏ, đặc hoặc mềm. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng chanh, vàng, da cam hoặc xanh xám, chuyển sang nâu đến nâu sẫm khi già. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,5-7,5 và 20-30^oC. Có khả năng phân hủy có chất cheratin (lông tóc của động vật có vú). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%.

Loài chuẩn: Pilimelia terevasa

Chi Dactylosporangium:

Túi bào tử hình ngón tay hoặc hình chùy được hình thành từ cuống sinh bào tử ngắn của khuẩn ty cơ chất. Các túi bào tử phát triển đơn lẻ hoặc tụ thành từng đám trên bề mặt cơ chất. Mỗi túi bào tử chứa một dãy gồm ba đến bốn bào tử. Bào tử có hình chữ nhật, hình elip, hình trứng hoặc hơi trụ, có khả năng di động nhờ một túm tiên mao cực. Không có khuẩn ty khí sinh thực sự. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,5-1,0 μm, phân nhánh và ít khi có vách ngăn. Gram dương , Không nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại môi trường. Khuẩn lạc đặc, hơi thô, thường phẳng, đôi khi nhô lên một bề mặt trơn hoặc hơi nhăn. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng xanh, da cam, đỏ hay nâu. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,0-7,0 và 25-37^oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.

Loài chuẩn: Dactylosporangium aurantiacum

Chi Micromonospora:

Có hệ sợi sinh trưởng mạnh, phân nhánh, có vách ngăn, đường kính trung bình 0,5 μm. Bào tử không có khả năng di động mọc trực tiếp hoặc từ cuống sinh bào tử. Không có khuẩn ty khí sinh. Gram dương,  không nhuộm kháng acid. Thành tế bào bào chứa meso-DAP, và/ hoặc acid 3-hydroxy diaminopimelic, glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Thành phần phospholipid gồm photphatidylethanolamin, photphatidylinositol và photphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H₄), MK-10(H₄), MK-10(H₆) và MK-12(H₆). Hiếu khí đến vi hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhạy cảm với pH dưới 6,0. Có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 20-40^oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.

Loài chuẩn: Micromonospora chalcea

Chi Streptomyces:

Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất. Bào tử không có khả năng di động. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ. Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh. Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon duy nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 ^oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa acid mycolic. Thành phần acid béo gồm phần lớn acid béo bão hòa, iso- và anteiso-. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H₆), MK-9(H_8­). Thành phần phospholipid chính là diphotphatidylglycerol, photphatidylethanolamine, photphatidylinositol và photphatidylinositol mannoside. Có nhiều trong đất, phân compôt. Một số loài gây bệnh cho người và động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-78%.

Loài chuẩn: Streptomyces albus

Chi Actinomadura:

Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, rất phát triển. Khuẩn ty cơ chất không đứt đoạn, có hoặc không có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành sẽ hình thành chuỗi ngắn, đôi khi dài của các bào tử đốt (arthrospore). Chuỗi bào tử có thể ở dạng thẳng, uốn cong hoặc xoắn không đều (1-4 vòng). Bề mặt bào tử nhẵn hoặc có các nốt. Khuẩn ty khí sinh khi đã hình thành bào tử có màu trắng, xám hay nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam hay tím. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ sinh trưởng từ 20 đến 45^oC. Một số loài ưa nhiệt. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa acid mycolic. Tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H₄) và MK-9(H₆). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 65-69%.

Loài chuẩn: Actinomadura madurae

Chi Microbispora:

Khuẩn ty khí sinh phân nhánh, hình thành từng cặp hai bao tử gắn với nhau. Bào tử mọc trực tiếp hoặc trên cuống sinh bào tử ngắn, hình cầu hoặc oval, đường kính trung bình 1,2-1,6μm và không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H₄). Thành phần phospholipid chính chứa photphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm và ưa nhiệt. Hầu hết các loài để sinh trưởng đều cần các vitamin nhóm B, đặc biệt là thiamin. Trong tự nhiên thường tồn tại trong dầu. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.

Loài chuẩn: Microbispora rosea

Chi Streptosporangium:

Túi bào tử hình cầu đường kính khoảng 10μm được hình thành trên khuẩn ty khí sinh. Các bào tử được hình thành bằng cách hình thành vách ngăn của sợi cuộn xoắn không phân nhánh bên trong túi bào tử. Bào tử hình cầu, hình oval hoặc hình que, không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần phospholipid chính chứa photphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm, một số loài có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Một số loài cần các vitamin nhóm B cho sinh trưởng. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-71%.

Loài chuẩn: Streptosporangium roseum

Chi Thermomonospora:

Khuẩn ty khí sinh sản sinh ra các bào tử đơn lẻ, bền nhiệt, không có khả năng di động. Bào tử có thể sinh trực tiếp nhưng thường là trên đầu của các cuống sinh bào tử có hoặc không phân nhánh. Bào tử cũng có hể được sinh ra từ khuẩn ty cơ chất. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP nhưng không chứa các loại acid amin hay đường đặc trưng. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Cần cung cấp nguồn    acid amin và các vitamin cho sinh trưởng như cao nấm men. Tất cả các chủng đều có thể sinh trưởng được ở nhiệt độ 40-48^oC, pH 7,0-9,0. pH > 8,0 thích hợp cho sự sản sinh khuẩn ty khí sinh và hình thành bào tử. Sản sinh catalase, deaminase, β-glucosidase và β-galactosidase. Có khả năng phân giải esculin, xylan, casein, gelatin và cacboxymetylcellulose. Bào tử chết ở 90^oC trong 30 phút trong nước. Tất cả các chủng đều nhạy cảm với novobiocin (50 μg/ml). Có thể phân lập được từ đất nhưng tồn tại nhiều trong phân bón, phân compôt và cỏ khô đã sấy.

Loài chuẩn: Thermomonospora curvata

Chi Actinosynnema:

Khuẩn ty gồm hai loại là khuẩn ty cơ chất hình thành bó sợi (synnemata) trên bề mặt thạch và khuẩn ty khí sinh hình thành từ bó sợi. Khuẩn ty sinh ra các chuỗi bào tử. Các bào tử có khả năng hình thành tiên mao trong môi trường nước. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, glucosamin và acid muramic. Tế bào không chứa thành phần đường đặc trưng. Thành phần phospholipid chính là photphatidylinositol mannoside, photphatidylinositol, photphatidylethanolamine và photphatidylglycerol. Acid béo gồm loại mạch thẳng và mạch nhánh. Thành phần menaquinon chính là MK-9(H₄) và MK-9(H₆). Gram dương, không acid fast, sinh catalase. Hiếu khí. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Hầu hết các chủng được phân lập trực tiếp từ mô thực vật như lá cỏ bên bờ sông. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 73%.

Loài chuẩn: Actinosynnema mirum

Chi Nocardiopsis:

Khuẩn ty cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh nhiều, có thể đứt đoạn thành các thể hình cầu và hình que. Khuẩn ty khí sinh dài, phân nhánh không đều, thẳng, uốn hoặc hình zích zắc, đứt đoạn thành các bào tử với chiều dài khác nhau. Bào tử hình oval hoặc kéo dài, bề mặt nhẵn. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, không nhuộm kháng axít. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa đường đặc trưng, không có acid mycolic. Thành phần menaquinon chính là MK-10(H_2,4,6) hoặc MK-9(H_4,6). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64-69%.

Loài chuẩn: Nocardiopsis dassonvillei

Dưới đây là hình ảnh một số chi xạ khuẩn thường gặp:

Frankia cộng sinh ở rễ cây

Phi lao, hình dưới- nang bào

 Nocardia- Khuẩn lạc và khuẩn ty đứt đoạn

                   Một số loài Streptomyces

Một số chi xạ khuẩn: A-Microtetraspora; B- Planomonospora; C- Actinosynnema; D- Actinobispora; E- Saccharothrix; F- Crosiella

Chi Actinomadura

Các chi: A- Micromonospora;

B-  Dactylosporangium; C- Verrucosispora

                                               D- Pilimelia; E- Catenuplanes                                                

Chi Actinoplanes

Loài Actinomyces viscosus

Trên đây là quan hệ phát sinh chủng loại của khoảng 90 chi xạ khuẩn khác nhau

Một số phương pháp phân lập xạ khuẩn:

Môi trường HV (Humic acid-vitamin agar)

Thành phần:

Acid humic                     1 g

CaCO­₃                                0,02 g

FeSO₄.7H₂O                            0,01 g

KCl                                1,71 g

MgSO₄.7H₂O                 0,05 g

Na₂HPO₄                       0,5 g

Hỗn hợp vitamin nhóm B*        5 ml

Cycloheximide               500 mg

Thạch                                      18 g

Nước cất                        1 L

pH                                 7,2

*Hỗn hợp vitamin nhóm B

Thiamine-HCl                 10 mg

Riboflavin                       10 mg

Niacin                            10 mg

Pyridoxin-HCl                10 mg

Inositol                           10 mg

Ca-Pantothenate              10 mg

Acid p-Aminobenzoic      10 mg

Biotin                             10 mg

Nước cất                        100 ml

Môi trường YS (Yeast extract-Soluble starch agar)

Cao nấm men                 2 g

Tinh bột tan                  10 g

Thạch                                    18 g

Nước cất                        1 L

pH                                7,3

Thường sử dụng môi trường YS pha loãng 5 lần để phân lập xạ khuẩn và pha loãng 2 lần để nghiên cứu.

Môi trường Maltose-Bennette

Cao nấm men                 1 g

Cao thịt                          1 g

NZ amine                        2 g

Maltose monohydrat      10 g

Thạch                                    18 g

Nước cất                        1 L

pH                                7,3

Môi trường ISP-2

Cao nấm men                 4 g

Cao malt                       10 g

Glucose                          4 g

Thạch                                    18 g

Nước cất                        1 L

pH                                 7,2

Môi trường dịch thể YG (Yeast extract-Glucose)

Yeast extract                  1%

Glucose                          1%

Phương pháp RC (Rehydration- Centrifugation method): dùng để phân lập xạ khuẩn có khả năng di động

-         Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu

-         Lấy 0,5 g mẫu cho vào 50 ml đệm photphat 10 mM- 5% cao nấm men (pH 7)

-         Loại bỏ phần nổi trên bề mặt

-         Giữ ở 28^oC trong 1,5 giờ

-         Chuyển 8 ml lớp dịch phía trên sang ống ly tâm

-         Ly tâm với tốc độ 3000 rpm (1500 x g) trong 20 phút

-         Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

-         Chuyển 3 ml lớp dịch trên sang ống khác.

-         Lấy 1 ml pha loãng với nước cất (10^-3, 10^-4)

-         Trải trên môi trường HV với độ pha loãng 10^-2, 10^-3, 10^-4

-         Nuôi cấy ở nhiệt độ 28^oC trong 14-21 ngày

Phương pháp SDS-YE (Sodium dodecyl sulfate – Yeast extract method): dùng để phân lập tất cả các loại xạ khuẩn

-         Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu

-         Lấy 1 g mẫu cho vào 10 ml nước cất vô trùng (10^-1)

-         Lấy 1 ml dịch trên cho vào 9 ml SDS-YE trong đệm photphat (10^-2) (SDS 0,05%, cao nấm men 6%, đệm photphat 5mM, pH 7,0)

-         Sốc nhiệt ở 40^oC trong 20 phút

-         Pha loãng bằng nước cất vô trùng

-         Trải trên môi trường HV

-         Nuôi cấy ở 28^oC trong 14-21 ngày

Phương pháp DH (Dry heating method): dùng để phân lập xạ khuẩn chủ yếu thuộc chi Streptomyces

-         Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu

-         Sấy mẫu ở 100^oC trong 30 phút

-         Rắc một lượng rất nhỏ mẫu lên môi trường HV

-         Nuôi cấy ở 28^oC trong 7-14 ngày

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn:

Chuẩn bị thành tế bào

1.     Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4^oC.

2.     Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch trên.

3.     Thêm 3ml SDS 4% (SDS có tác dụng loại lipid và protein). Nếu dừng công việc ở đây, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng.

4.     Giữ ở 100^oC trong 40 phút, nhớ vặn chặt nắp.

5.     Ly tâm với tốc độ 17000 rpm trong 30 phút ở 30^oC (nếu giữ ở nhiệt độ thấp, SDS sẽ bị kết tinh). Loại bỏ dịch trên.

6.     Rửa với nước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000rpm, 30 phút)

7.     Nếu cần thiết, xử lý bằng RNase và DNase.

8.     Đông khô qua đêm.

Phân tích thành phần acid amin trong thành tế bào

1.     2-3mg thành tế bào + 200μl HCl 4N, vặn chặt nắp, giữ ở 100^oC qua đêm

2.     Làm khô bằng hút chân không (khoảng 1 ngày 1 đêm)

3.     Thêm 200 μl nước cất, trộn đều, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 5 phút. Lọc mẫu.

4.     Chạy sắc ký bản mỏng TLC:

     -      Dung môi:

Methanol        80ml

Nước cất     17.5ml

6N HCl            4ml

Pyridine         10ml

-         Cellulose TLC

-         Chuẩn (1μl): DAP, Ala, Gly, Glu, Lys

-         Mẫu: 3-5μl

-         Nhận biết bằng phun ninhydrin, giữ ở 100^oC trong 5 phút. Các acid amin sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu tím. Để lâu, các chấm này dần dần biến mất, nhưng riêng chấm của DAP sẽ chuyển sang màu vàng.

5.     Chuẩn bị mẫu chạy HPLC: chuẩn bị cho cả mẫu và chuẩn

-         10-20 μl (25nmol) mẫu, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)

-         Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine 2/2/1, trộn đều, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)

-         Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine/Phenylisothiocyanate 7/1/1/1, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)

-         Thêm 0.5ml dung dịch A(dich chạy HPLC), lọc mẫu dùng làm mẫu chạy HPLC

Điều kiện chạy HPLC

-         Độ hấp thụ (absorbance) 0.01

-         Sử dụng UV detector ở bước sóng 254nm

-         Dung dịch A: 6% CH₃CN, dung dịch B: 60% CH₃CN

-         Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút

Chương trình

Phân tích thành phần menaquinone

1.     100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 2-3 giờ.

2.     Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay

3.     Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút chân không

4.     Thêm 50 μl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng và nhiệt độ cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy).

5.     Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone.

6.     Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml acetone, trộn đều.

7.     Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ lỏng.

8.     Thêm 50-100 μl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass spectrometer (MS)

9.     Điều kiện chạy HPLC

-   Dung môi: Methanol: Propanol (2:1)

-         Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min

-         Nhiệt độ cột: 40^oC

-         Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm

Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MS chính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồi so với giá trị trong bảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối cùng và cao nhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H₄) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12.

Phân tích thành phần đường trong tế bào

1.     30-50mg tế bào khô + 1ml H₂SO₄ 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100^oC trong 2 giờ.

2.     Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch Ba(OH)₄ bão hòa.

3.     Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, chuyển dịch trên sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không

4.     Hòa tan bằng 300 μl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu.

5.     Chạy sắc ký bản mỏng TLC:

-         TLC cellulose

-         3 μl mẫu

-         1 μl chuẩn

Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước

Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước

Chuẩn 3: madurose (3-O-methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước

-     Dung môi chạy TLC: n-buthanol:water:pyridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v)

-         Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 ml dung dịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100^oC trong 4 phút 

-         Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp dưới

Chuẩn 1:          Glucose: vàng

                            Mannose: vàng

                            Ribose: đỏ

                            Rhamnose: vàng

      Chuẩn 2:                  Galactose: vàng

                            Arabinose: đỏ

                            Xylose: đỏ

      Chuẩn 3:         Madurose: vàng

6.     Điều kiện chạy HPLC:

-         Cột: cột trao đổi anion

-         Dung dịch A: Acid boric 0.1 M

+ Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW

+ Thêm KOH 4M đến pH 8

-         Dung dịch B: Acid boric 0.4M

-         + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW

+ Thêm KOH 4M đến pH 9

-         Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min

-         Nhiệt độ: 65^oC

-         Phản ứng nhận biết:

Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW

Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min

Nhiệt độ: 150^oC

Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm

          Chương trình

Thời gian (phút)    Nồng độ Sol B

         0                          0                 Dung dịch C: 0.2ml/min

         50                         100                                                                      57                        100                                                                      57.1                      0                                                                         65                         dừng

Phân tích thành phần acid béo

1.     5mg  tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex  5- 10 sec, giữ ở 100^oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100^oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80^oC

2.     Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80^oC trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng

3.     Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước)

4.     Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu)

5.     Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa.

Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80^oC.

R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml

R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5

R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml

R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml

R5: 100ml MQ + 40g NaCl

6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI)

Phân tích thành phần phospholipid

1.     100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút.

2.     Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa.

3.     Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20^oC.

4.     Hòa tan bằng 100 μl ethanol.

5.     Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance)

6.     Dung môi chạy TLC chiều 1:

Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4

Dung môi chạy TLC chiều 2:

Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard

Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5

7.     Nhận biết các loại phospholipid:

Bản 1: Nhận biết các glycolipit:

Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde:

     Acetic acid           1ml

     p-anisaldehyde      5ml

     H₂SO₄                            5ml

     Ethanol                 90ml

Phun thuốc thử, giữ ở 110^oC trong 15 phút

Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh.

Bản 2: Nhận biết các amino lipit

-         Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120^oC trong vài phút.

-         Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG

Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester

-   Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester:

Sol I       25N H₂SO₄ 100mg

              MoO₃                   4,011g

              Hòa tan bằng cách đun ở 90^oC đến khi dung dịch trở nên trong

SolII       Iot               50mg

              Mo              0,178g

              Đun trong 15 phút, để nguội, lọc

Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh

-         Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên

Bản 3: Nhận biết các choline lipit

-         Thuốc thử Dragendorff:

Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH)₂NO₃]       1,7g

          Acetic acid                                            20ml

          Water                                          80ml

Sol B: KI                                                        10g

          Nước                                           25ml

Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước.

-         PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam

Bản 4:

-         Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid.

-         Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này cho thí nghiệm tiếp theo.

Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH

-         Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic

-         Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa

-         Phun nước (loại muối periodate)

-         Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng nhận biết bằng Iot biến mất.

-         Phun thuốc thử Schiff

-         PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa đường hiện lên màu xanh

Phân tích thành phần G+C trong ADN

1.     25μl ADN (2-25μg), giữ ở 60^oC trong 1 giờ. Giữ ở 100^oC trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down.

2.     Mẫu ADN 25μl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO₄ 25μl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25μl. Spin down. Giữ ở 37^oC trong 1 giờ.

3.     Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 μl + alkaline photphatase 2μl (0.35U/μl). Spin down. Giữ ở 37^oC trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC

4.     Điều kiện HPLC:

-         Cột Cosmosil5 C18

-         Nhiệt độ 35^oC

-         Dung môi: 0,2M ammonium photphat: acetonenitril (40:1)

-         Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min

-         Bước sóng: 275nm

Phương pháp tách ADN xạ khuẩn

-         Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28^oC

-         Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4^oC, thu sinh khối

-         Rửa bằng TE

-         Nghiền mẫu

-         Thêm 500 μl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều

-         Thêm 50 μl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37^oC trong 1 giờ

-         Thêm 50 μl SDS 20%, 50 μl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55^oC trong 30 phút

-         Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4^oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần.

-         Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều

-         Thu ADN bằng đũa thủy tinh

-         Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên

-         Thêm 500 μl TE

Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau:

-         Thêm 50 μl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 μl RNase T₁, giữ ở 37^oC trong 20 phút

-         Thêm 50 μl proteinase K, giữ ở 37^oC trong 1 giờ

-         Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4^oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần.

-         Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều

-         Thu ADN bằng đũa thủy tinh

-         Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên

-         Thêm 100-200 μl TE

Tài liệu tham khảo:

1.     Miyadoh S. (ed.). 1997. Atlas of actinomycetes. Asakura Publishing Co. Ltd, Japan.

2.     Miyadoh S. (ed.). 2001. Identification manual of actinomycetes. Business Center for Academic Societies Japan.

3.     Williams S. T.,M.E. Sharpe , J.G. Holt (ed.). 1989. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA.