2.3. Nhu cầu về O2
và CO2
Căn cứ vào nhu cầu đối với ôxy,
vi khuẩn được thành các nhóm hiếu khí, kỵ khí, kỵ
khí không bắt buộc và vi hiếu khí.
2.3.1. Nhu cầu đối với ôxy
·
Vi khuẩn đã hoạt
hoá cấy vào môi trường dịch thể thích hợp.
·
Đặt ở các điều
kiện: - không khí chứa 5% CO2 và 10% O2
- không khí bình thường.
Theo dõi sự phát triển của vi
khuẩn.
2.3.2. Tính kỵ khí của vi
khuẩn sinh bào tử
·
Chuẩn bị môi trường
thạch kỵ khí:
Casein thủy phân 20 g
NaCl 5 g
Na-mercaptoacetat 2 g
Na-formaldehyd sulfoxylate
1 g
Thạch 15 g
Nước
cất 1000 ml.
·
Cấy vi khuẩn theo
kiểu chích sâu 1 vòng que cấy (đường kính 1,5 mm)
vào môi trường nói trên.
·
Nuôi ở 30 0C,
kiểm tra kết quả sau 3 ngày và 7 ngày. Nếu vi khuẩn
mọc ở phía trên là thuộc loại hiếu khí; nếu mọc dọc
đường cấy là kỵ khí không bắt buộc; nếu chỉ mọc bên
dưới là kỵ khí bắt buộc.
2.4. Khả năng đồng
hóa các nguồn carbon
·
Môi trường khoáng
cơ bản (g/l):
(NH4)2SO4 2 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NaH2PO4.H2O 0,5 g
CaCl2.2H2O 0,1 g
K2HPO4 0,5 g
Nước
cất 1000 ml
·
Nguồn carbon (đường,
polysaccarid, rượu, axit béo, axit amin, axit hữu
cơ, hydroxy axit (alcohol axit,
dicarboxylic axit…) được khử trùng qua màng lọc.
·
Bổ sung nguồn
carbon vào môi trường khoáng cơ bản (đường và rượu ở
nồng độ 0,5-1%, các loại khác ở nồng độ 0,1-0,2%),
chia môi trường vào các ống nghiệm đã tiệt trùng.
·
Cấy vi khuẩn vào
môi trường, sử dụng 3 ống nghiệm đối với mỗi loại
nguồn carbon.
·
Theo dõi sự phát
triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon.
Cách khác là chuẩn bị môi trường
khoáng cơ sở có thạch và đổ đĩa Petri. Vi khuẩn được
cấy dàn đều trên đĩa bằng que gạt. Nguồn carbon ở
dạng tinh thể được đưa lên đĩa (khoảng bằng hạt gạo)
để cho khuyếch tán dần ra xung quanh. Nếu vi khuẩn
đồng hóa được nguồn carbon nào sẽ mọc thành vòng
xung quanh chỗ có đặt nguồn carbon đó.
Các nguồn carbon thường
được dùng trong thí nghiệm:
Đường 5C Arabinoza, Riboza,
Xyloza, Fucoza, Rhamnoza
Đường 6C Glucoza hay Dextroza,
Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza
Đường kép Saccharoza hay
Sucroza-Đường kính, Maltoza, Sorboza, Lactoza,
Trehaloza, Cellobioza, Melibioza
Đường tam Raffinoza,
Melizitoza
Đường đa Tinh bột
(Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen
Rượu bậc 3 Glycerol
Rượu bậc 4 Erythritol
Rượu bậc 5 Adonitol,
Arabitol, Xylitol
Rượu bậc 6 Mannitol,
Sorbitol, Dulcitol
Rượu bậc 6 mạch vòng
Inozitol
Glucoside Salicin, Coniferrin,
Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid
2.5. Khả năng đồng hóa các
nguồn nitơ
·
Môi trường cơ sở:
KH2PO4 1,36 g
CaCl2 5 ml
NaHPO4. 2,13 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,5 ml
Glucoza 10 g
Nước
cất 1000 ml
Glucoza có thể được thay thế bằng
nguồn carbon thích hợp khác như Citrat, Acetat,
Mannit… với nồng độ 0,2-0,5%. Các nguồn nitơ khác
nhau (muối ammon, muối nitơrat) được đưa vào môi
trường với nồng độ 0,05-0,1%. Đối chứng là môi
trường hoàn toàn không bổ sung nguồn nitơ. Chỉnh pH
tới 7,0-7,2.
Chia môi trường vào các ống
nghiệm (4-5 ml/ ống), khử trùng ở 112 0C
trong 20-30 phút.
·
Cấy vi khuẩn đã
hoạt hoá 18-24 giờ (3 ống cho mỗi loại nguồn nitơ).
·
Đặt ở nhiệt độ
thích hợp trong 3 ngày và 7 ngày. So sánh sự phát
triển với đối chứng (đo độ đục của dịch tế bào) để
xác định khả năng đồng hóa nguồn nitơ.
2.6. Khả năng sinh sắc tố
huỳnh quang
·
Môi trường làm ống
thạch nghiêng:
Pepton 20 g
Glyxerin 10 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 1,5 g
Thạch 15 g
Nước
cất 1000 ml
pH = 7,2.
Khử trùng ở 121 0C
trong 20 phút, đặt thạch nghiêng.
·
Cấy vi khuẩn đã
hoạt hóa 24 giờ lên mặt thạch, đưa vào tủ ấm và theo
dõi sau 1, 3, 5 ngày.
·
Quan sát ống nghiệm
dưới đèn tử ngoại xem có sản sinh sắc tố huỳnh quang
hay không?
2.7. Tính mẫn cảm đối với
chất kháng khuẩn
·
Chuẩn bị môi trường
thạch đĩa thích ứng với từng loại vi khuẩn.
·
Cấy gạt vi khuẩn
lên mặt thạch đĩa (có thể trộn vi khuẩn vào môi
trường thạch đã làm nguội tới 50 0C rồi
đổ đĩa).
·
Đặt lên mặt thạch
các khoanh giấy (tự chế hoặc mua sẵn) tẩm chất kháng
khuẩn ở các nồng độ khác nhau.
·
Nuôi trong tủ ấm 30
0C trong 24-48 giờ.
·
Quan sát các vòng
vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa
chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn tức là vi
khuẩn càng mẫn cảm.
Hình 2.2.
Vòng vô khuẩn tạo thành quanh các khoanh giấy thấm
chất kháng khuẩn.
2.8. Đồng hóa Malonat
·
Môi trường dịch
thể:
Cao men
1 g
(NH4)2SO4
2 g
K2HPO4
0,6 g
KH2PO4 0,4 g
Natri
malonat 3 g
Bromophenol blue
(BPB) 0,025 cg
Nước
cất 1000ml
pH= 7,0-7,4
·
Chia môi trường vào
ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15
phút.
Đối chứng là môi trường không có
Natri-malonat.
·
Cấy vi khuẩn đã
hoạt hóa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày.
·
Quan sát sự đổi mầu
của môi trường: nếu chuyển màu từ lục sang lam là có
đồng hóa malonat (dương tính), nếu không là âm tính.
Hình 2.3.
Sự đổi mầu của môi trường khi vi
khuẩn đồng hoá malonat.
2.9.
Xét
nghiệm đồng hóa Citrat
Mục đích:
phân biệt các nhóm vi khuẩn đường
ruột dựa trên khả năng đồng hoá citrat.
·
Môi trường Simmons:
NaCl
5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NH4H2PO4
1 g
K2HPO4.3H2O 1 g
Natri
xitrat 2 g
BPB 1% trong
nước 10 ml
Thạch (đã rửa
nước) 12 g
Nước
cất 990 ml.
Đun tan thạch, chỉnh pH đến 7,0,
thêm chỉ thị màu BPB và phân vào ống nghiệm để làm
thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 0C trong
15 phút.
·
Cấy vi khuẩn vào
ống thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3-7 ngày.
·
Môi trường biến màu
từ lam sang đỏ đào tức là vi khuẩn có khả năng đồng
hóa citrat (dương tính).
·
Với các loài
Bacillus cần sử dụng môi trường sau:
NaCl
1 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NH4H2PO4 0,5 g
Natri
xitrat 2 g
Nước
cất 1000 ml
Đỏ phenol (Phenol red)
0,04% 20
ml.
2.10. Nhu cầu muối
và tính chịu muối
·
Chuẩn bị môi trường
dịch thể thích hợp đối với từng loài vi khuẩn.
·
Bổ sung NaCl ở các
nồng độ 2, 5, 7, 10%, môi trường cần trong suốt.
·
Cấy vi khuẩn đã
hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày.
·
Theo dõi mức độ
sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi
khuẩn làm đối chứng).
2.11. Khả năng đồng
hóa Tartrat
·
Môi trường dịch thể
để kiểm tra:
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Nước
cất 1000 ml
BPB
(0,2%) 12,5 ml
Kali
tartrat 10 g
Chỉnh pH = 7,4.
Phân môi trường vào ống nghiệm,
khử trùng ở 115 0C trong 20 phút, nên
dùng ngay. Nếu để môi trường
quá 14 ngày thì cần khử trùng lại bằng đun cách thủy
10 phút.
·
Cấy vi khuẩn vào môi
trường, hàng ngày theo dõi sự đổi màu.
·
Sau 14 ngày thêm một
lượng dung dịch chì acetat bão hòa trung tính bằng
thể tích môi trường (vol/vol).
Đối chứng là môi trường không cấy
vi khuẩn.
·
Nếu có chuyển sang
màu lục vàng và có ít chì acetat kết tủa là có khả
năng đồng hóa tartrat (dương tính). Nếu màu vàng hay
màu lục và có nhiều chì acetat kết tủa là xét nghiệm
âm tính.
·
Phản ứng này dùng
để phân biệt Salmonella zava (dương tính) và
Salmonella paratyphi B (âm tính).
2.12. Khả năng sinh
trưởng với KCN
KCN có tác dụng ức chế
Escherichia coli nhưng không ức chế
Citrobacter freundi, vì thế thường được dùng để
phân biệt 2 loài này.
·
Môi trường cơ sở:
Pepton 3 g
NaCl 5 g
KH2PO4 0,22 g
K2HPO4 5,64 g
Nước
cất 1000 ml.
pH = 7,6.
Khử trùng ở 115 0C
trong 20 phút. Để môi trường vào tủ lạnh cho nguội
đến 4 0C, thêm 15ml dung dịch KCN 0,5%,
phân vào mỗi ống nghiệm 1ml (thao tác vô trùng); có
thể bảo quản được trong 2 tuần. Môi trường đối
chứng không thêm dung dịch KCN.
·
Cấy vi khuẩn từ mới
hoạt hoá (24 giờ) vào các môi trường đã chuẩn bị
trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 4 ngày và quan
sát sự chuyển màu của môi trường.
·
Nếu môi trường
chuyển màu đỏ là sinh trưởng dương tính (Citrobacter
freundii), nếu môi trường vẫn không màu là sinh
trưởng âm tính (Escherichia coli).
3. CÁC ĐẶC ĐIỂM
SINH HÓA:
3.1. Xét nghiệm oxidaza
Mục đích:
phân biệt các nhóm vi khuản dựa
trên hoạt tính cytochrom oxidaza
·
Pha dung dịch
Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD)
1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4
°C,
sử dụng trong 2 tuần.
·
Đặt một miếng giấy
lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1%
lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để
quá ướt.
·
Dùng que cấy có đầu
que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh
(không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt,
niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24
giờ) bôi lên miếng giấy lọc.
·
Sau 10 giây nếu vi
khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương
tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm
tính.
·
Chú ý: nếu dung
dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được
sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc
tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên
âm tính giả.
3.2.
Xét
nghiệm catalaza
Mục đích:
kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2
của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
·
Chuẩn bị dung dịch
H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một
giọt lên phiến kính.
·
Dùng đầu que cấy
platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ)
trộn vào giọt H2O2 trên phiến
kính.
·
Nếu thấy sủi bọt là
dương tính, không sủi bọt là âm tính.
·
Có thể nhỏ trực
tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn
lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự.
Hình 3.1.
Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H2O2
của vi khuẩn có catalaza dương tính.
3.3.
Khả năng
lên men/ôxy hóa glucoza
Có thể dùng một trong hai môi trường
sau để làm thí nghiệm
·
Môi trường I:
Pepton 2 g
NaCl 5 g
K2HPO4 0,2 g
Glucoza 10 g
Thạch 6 g
Dung dịch BTB 1%
3 ml (pha trong một ít cồn 95%, sau đó mới thêm nước để
thành dung dịch 1%)
Nước
cất 1000 ml.
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào các ống
nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong
20 phút.
·
Môi trường II:
NH4H2PO4 0,5 g
K2HPO4 0,5 g
Cao
men 0,5 g
Glucoza 10 g
Thạch
5-6 g
Dung dịch BTB 1%
3 ml (pha như trên)
Nước
cất 1000 ml
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào ống nghiệm và
khử trùng như trên.
·
Lấy vi khuẩn mới
hoạt hoá (18-24 h) cấy chích sâu vào môi trường bằng
que cấy thẳng (mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 4 ống).
Bịt kín 2 ống nút bông bằng vaselin-paraffin (lấy
vaselin làm chảy ra, thêm 1/3 dầu paraffin) để cách
ly với không khí. Ngoài ra lấy thêm 2 ống không cấy
vi khuẩn làm đối chứng. Theo dõi kết quả sau 1,2,3,7
và 14 ngày.
·
Kết quả: - Nếu chỉ
có ống không bịt kín sinh axit (chuyển màu vàng)
tức là vi khuẩn thuộc dạng ôxy
hóa.
- Nếu cả ống không bịt và ống bịt
kín đều sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn
thuộc dạng lên men.
3.4. Khả năng lên men đường,
rượu
· Môi trường:
Cao thịt
3 g
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Chất chỉ thị màu
Andrade* 10 ml
(hay dung dịch Xanh bromophenol
0,2%)
Nước
cất thêm đến 1000 ml
·
Bổ sung đường với
nồng độ 0,5%. Phân môi trường vào các ống nghiệm,
mỗi ống 1ml.
·
Đặt vào mỗi ống
nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng
khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng
lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C.
Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử
trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi
trường.
* Cách pha chất chỉ thị màu
Andrade:
Fuchsin
axit 0,5 g
NaOH 1M
16 ml
Nước
cất 100 ml
Nếu dung dịch có màu hồng, dùng
NaOH 0,1 M (1-2 ml) để trung hòa cho đến khi mất
màu.
Xanh
bromophenol (BPB):
2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M,
nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.
·
Cấy vi khuẩn mới hoạt
hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo
dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp
cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi
trong 14-30 ngày
·
Nếu vi khuẩn có khả
năng lên men đường (sinh axit) thì chất chỉ thị
Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển
màu vàng lục.
Có thể làm cách khác như sau:
·
Với vi khuẩn nói chung
dùng môi trường I (xem mục 3.3), thay glucoza các
đường khác hay rượu (nồng độ 1).
·
Với vi khuẩn sinh bào
tử dùng môi trường sau:
(NH4)2HPO4
1 g
KCl
0,2 g
MgSO4 0,2 g
Cao men
0,2 g
Thạch 5-6 g
Đường hay rượu
10 g
Nước
cất 1000 ml
Dung dịch BTB 0,04%
15 ml
pH = 7,0-7,2.
Phân môi trường vào các ống nghiệm
(4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 30
phút.
·
Với vi khuẩn lactic
dùng môi trường sau:
Pepton 5 g
Cao
thịt 5 g
Cao
men 5 g
Tween
80 0,5 ml
Thạch 5-6 g
Nước cất (hay nước máy)
1000
ml
Dung dịch BTB 1,6%
1,4
ml
pH = 6,8-7,0.
Phân môi trường vào ống nghiệm, khử
trùng tại 112 0C trong 30 phút.
·
Lấy vi khuẩn mới hoạt
hoá (18-24 giờ) cấy trích sâu vào môi trường thạch,
đặt ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1,3,5 ngày.
·
Nếu chỉ thị màu biến
vàng là vi khuẩn có khả năng lên men sinh axit (phản
ứng dương tính); nếu vẫn giữ màu lam là phản ứng âm
tính.
3.5. Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl
- Methyl Red)
·
Môi trường:
Pepton 5 g
Glucoza
5 g
K2HPO4 hoặc
NaCl
5 g
Nước
cất 1000 ml.
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào ống nghiệm
(4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 30
phút.
·
Thuốc thử:
Đỏ
Methyl 0,1 g
Etanol
95% 300 ml
Nước
cất 200 ml.
·
Cấy vi khuẩn vào
môi trường (lặp lại 2 lần), đặt ở nhiệt độ thích hợp
trong 2-6 ngày (nếu kết quả âm tính cần kéo dài thêm
thời gian). Với Vi khuẩn đường ruột thuộc họ
Enterobacteriaceae, đặt ống nuôi cấy ở 37 0C
và kiểm tra sau 4 ngày.
·
Nhỏ 1 giọt thuốc
thử vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển màu đỏ là phản ứng
dương tính, màu vàng là âm tính (màu đỏ ở pH 4,4;
màu vàng ở pH 6,0).
Hình 3.2.
Chất chỉ thị đỏ methyl chuyển màu khi tiếp xúc
với dịch nuôi cấy vi khuẩn lên
men đường.
3.6. Phản ứng V.P.
(Voges-Proskauer)
·
Môi trường: xem phần
3.5.
·
Thuốc thử:
Creatin 0,3%
(hoặc để nguyên dạng tinh thể)
NaOH 40%
·
Cấy vi khuẩn mới
hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày.
·
Bổ sung NaOH 40%
(bằng thể tích dịch nuôi cấy), sau đó
nhỏ một ít dung dịch creatin (hoặc
thêm một ít tinh thể), đợi khoảng 10 phút (có khi
lâu hơn). Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng
dương tính.
Cách khác:
·
Môi trường Clark-Lubs:
Pepton 3 g
K2HPO4
5 g
Glucoza
5 g
pH = 7,5.
·
Phản ứng V.P: nhỏ 5
giọt dung dịch alpha naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ
ở 4
°C
trước khi dùng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), lắc
nhẹ. Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu là phản ứng
dương tính, màu vàng nhạt là âm tính.
·
Phản ứng M.R: nhỏ 2-3
giọt dung dịch Đỏ methyl 0,5% (trong cồn 60%), lắc
nhẹ. Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương
tính, màu vàng nhạt hay không màu là âm tính.
Hình 3.3.
Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng V.P. và M.R.
3.7. Phản ứng ONPG-aza
(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase)
·
Môi trường:
ONPG 0,6 g
Đệm phosphat 0,01M pH
7,5 100
ml
Dung dịch pepton 1% (pH
7,5) 300 ml.
(Hoà 0,6 g ONPG trong 100 ml dung
dịch đệm, khử trùng bằng màng lọc, sau đó trộn với
300 ml dung dịch pepton đã khử trùng).
Bằng thao tác vô khuẩn phân môi
trường vào các ống nghiệm nhỏ, bảo quản ở 4
°C
trong vòng 1 năm.
·
Cắt những khoanh giấy
lọc, khử trùng 112
°C,
30 phút.
·
Nhỏ vào mỗi khoanh
giấy lọc một giọt dung dịch sau:
ONPG
0,06 g
Na2HPO4.2H2O
0,017 g
Nước
cất 10 ml
Làm khô ở 37 0C trong 24
giờ, bảo quản trong các ống nghiệm có nút xoáy ở
nhiệt độ phòng.
·
Cấy vi khuẩn mới hoạt
hoá (1 vòng que cấy) vào môi trường đã chuẩn bị như
trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.
·
Ly tâm dịch nuôi cấy
thu tế bào, làm dịch huyền phù đậm đặc trong 0,5 ml
nước muối sinh lý.
·
Đưa khoanh giấy ONPG
vào dịch huyền phù, giữ ở 35-37 0C trong
24 giờ.
Quan sát kết quả: màu vàng là phản ứng dương tính (Escherichia
coli); không màu là âm tính (Salmonella
paratyphi B).
|