Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi khuẩn

Vietsciences-Nguyễn Lân Dũng   - Đinh Thúy Hằng  26/04/2006

 

 

2.3.   Nhu cầu về O2 và CO2

Căn cứ vào nhu cầu đối với ôxy, vi khuẩn được thành các nhóm hiếu khí, kỵ khí, kỵ khí không bắt buộc và vi hiếu khí.

 

2.3.1. Nhu cầu đối với ôxy

·        Vi khuẩn đã hoạt hoá cấy vào môi trường dịch thể thích hợp.

·        Đặt ở các điều kiện:   - không khí chứa 5% CO2 và 10% O2

   - không khí bình thường.

Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.

 

2.3.2. Tính kỵ khí của vi khuẩn sinh bào tử

·        Chuẩn bị môi trường thạch kỵ khí:

Casein thủy phân                          20 g

NaCl                                             5 g

Na-mercaptoacetat                      2 g

Na-formaldehyd sulfoxylate          1 g

Thạch                                          15 g

Nước cất                                     1000 ml.

·        Cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu 1 vòng que cấy (đường kính 1,5 mm) vào môi trường nói trên.

·        Nuôi ở 30 0C, kiểm tra kết quả sau 3 ngày và 7 ngày. Nếu vi khuẩn mọc ở phía trên là thuộc loại hiếu khí; nếu mọc dọc đường cấy là kỵ khí không bắt buộc; nếu chỉ mọc bên dưới là kỵ khí bắt buộc.

 

2.4.   Khả năng đồng hóa các nguồn carbon

·        Môi trường khoáng cơ bản (g/l):

 

(NH4)2SO4                 2 g

MgSO4.7H2O             0,2 g

NaH2PO4.H2O            0,5 g

CaCl2.2H2O               0,1 g

K2HPO4                     0,5 g

Nước cất                   1000 ml

·        Nguồn carbon (đường, polysaccarid, rượu, axit béo, axit amin, axit hữu cơ, hydroxy axit (alcohol axit, dicarboxylic axit…) được khử trùng qua màng lọc.

·        Bổ sung nguồn carbon vào môi trường khoáng cơ bản (đường và rượu ở nồng độ 0,5-1%, các loại khác ở nồng độ 0,1-0,2%), chia môi trường vào các ống nghiệm đã tiệt trùng.

·        Cấy vi khuẩn vào môi trường, sử dụng 3 ống nghiệm đối với mỗi loại nguồn carbon.

·        Theo dõi sự phát triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon.

Cách khác là chuẩn bị môi trường khoáng cơ sở có thạch và đổ đĩa Petri. Vi khuẩn được cấy dàn đều trên đĩa bằng que gạt. Nguồn carbon ở dạng tinh thể được đưa lên đĩa (khoảng bằng hạt gạo) để cho khuyếch tán dần ra xung quanh. Nếu vi khuẩn đồng hóa được nguồn carbon nào sẽ mọc thành vòng xung quanh chỗ có đặt nguồn carbon đó.

 

Các nguồn carbon thường được dùng trong thí nghiệm:

Đường 5C   Arabinoza, Riboza, Xyloza, Fucoza, Rhamnoza

Đường 6C   Glucoza hay Dextroza, Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza

Đường kép  Saccharoza hay Sucroza-Đường kính, Maltoza, Sorboza, Lactoza, Trehaloza, Cellobioza, Melibioza

Đường tam           Raffinoza, Melizitoza

Đường đa             Tinh bột (Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen

Rượu bậc 3           Glycerol

Rượu bậc 4           Erythritol

Rượu bậc 5           Adonitol, Arabitol, Xylitol

Rượu bậc 6           Mannitol, Sorbitol, Dulcitol

Rượu bậc 6 mạch vòng            Inozitol

Glucoside    Salicin, Coniferrin, Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid

 

2.5.   Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ

·        Môi trường cơ sở:

KH2PO4             1,36 g

CaCl2                 5 ml

NaHPO4.             2,13 g

MgSO4.7H2O       0,2 g

FeSO4.7H2O        0,5 ml

Glucoza               10 g

Nước cất              1000 ml

Glucoza có thể được thay thế bằng nguồn carbon thích hợp khác như Citrat, Acetat, Mannit… với nồng độ 0,2-0,5%. Các nguồn nitơ khác nhau (muối ammon, muối nitơrat) được đưa vào môi trường với nồng độ 0,05-0,1%. Đối chứng là môi trường hoàn toàn không bổ sung nguồn nitơ. Chỉnh pH tới 7,0-7,2.

Chia môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml/ ống), khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút.

·        Cấy vi khuẩn đã hoạt hoá 18-24 giờ (3 ống cho mỗi loại nguồn nitơ).

·        Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày và 7 ngày. So sánh sự phát triển với đối chứng (đo độ đục của dịch tế bào) để xác định khả năng đồng hóa nguồn nitơ.

 

2.6.   Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang

·        Môi trường làm ống thạch nghiêng:

Pepton                 20 g

Glyxerin               10 g

K2HPO4                1,5 g

MgSO4.7H2O        1,5 g

Thạch                   15 g

Nước cất              1000 ml

pH = 7,2.

Khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, đặt thạch nghiêng.

·        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa 24 giờ lên mặt thạch, đưa vào tủ ấm và theo dõi sau 1, 3, 5 ngày.

·        Quan sát ống nghiệm dưới đèn tử ngoại xem có sản sinh sắc tố huỳnh quang hay không?

 

2.7.   Tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn

·        Chuẩn bị môi trường thạch đĩa thích ứng với từng loại vi khuẩn.

·        Cấy gạt vi khuẩn lên mặt thạch đĩa (có thể trộn vi khuẩn vào môi trường thạch đã làm nguội tới 50 0C rồi đổ đĩa).

·        Đặt lên mặt thạch các khoanh giấy (tự chế hoặc mua sẵn) tẩm chất kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau.

·        Nuôi trong tủ ấm 30 0C trong 24-48 giờ.

·        Quan sát các vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn tức là vi khuẩn càng mẫn cảm.

 

Hình 2.2.         Vòng vô khuẩn tạo thành quanh các khoanh giấy thấm chất kháng khuẩn.

 

 

2.8.   Đồng hóa Malonat

 

·        Môi trường dịch thể:

Cao men                              1 g

(NH4)2SO4                           2 g

K2HPO4                               0,6 g

KH2PO4                               0,4 g

Natri malonat                      3 g

Bromophenol blue (BPB)      0,025 cg

Nước cất                              1000ml

pH= 7,0-7,4

·        Chia môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.

Đối chứng là môi trường không có Natri-malonat.

·        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày.

·        Quan sát sự đổi mầu của môi trường: nếu chuyển màu từ lục sang lam là có đồng hóa malonat (dương tính), nếu không là âm tính.

Hình 2.3.         Sự đổi mầu của môi trường khi vi khuẩn đồng hoá malonat.


 

2.9.         Xét nghiệm đồng hóa Citrat

 

Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuẩn đường ruột dựa trên khả năng đồng hoá citrat.

·        Môi trường Simmons:

NaCl                                               5 g

MgSO4.7H2O                                  0,2 g

NH4H2PO4                                      1 g

K2HPO4.3H2O                                 1 g

Natri xitrat                                       2 g

BPB 1% trong nước                         10 ml

Thạch (đã rửa nước)                        12 g

Nước cất                                         990 ml.

Đun tan thạch, chỉnh pH đến 7,0, thêm chỉ thị màu BPB và phân vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.

·        Cấy vi khuẩn vào ống thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3-7 ngày.

·        Môi trường biến màu từ lam sang đỏ đào tức là vi khuẩn có khả năng đồng hóa citrat (dương tính).

·        Với các loài Bacillus cần sử dụng môi trường sau:

NaCl                                          1 g

MgSO4.7H2O                             0,2 g

NH4H2PO4                                 0,5 g

Natri xitrat                                 2 g

Nước cất                                   1000 ml

Đỏ phenol (Phenol red) 0,04%    20 ml.

 

2.10.           Nhu cầu muối và tính chịu muối

·        Chuẩn bị môi trường dịch thể thích hợp đối với từng loài vi khuẩn.

·        Bổ sung NaCl ở các nồng độ 2, 5, 7, 10%, môi trường cần trong suốt.

·        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày.

·        Theo dõi mức độ sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi khuẩn làm đối chứng).

 

2.11.           Khả năng đồng hóa Tartrat

·        Môi trường dịch thể để kiểm tra:

Pepton                            10 g

NaCl                                5 g

Nước cất                         1000 ml

BPB (0,2%)                     12,5 ml

Kali tartrat                       10 g

Chỉnh pH = 7,4.

Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 115 0C trong 20 phút, nên dùng ngay. Nếu để môi trường quá 14 ngày thì cần khử trùng lại bằng đun cách thủy 10 phút.

·        Cấy vi khuẩn vào môi trường, hàng ngày theo dõi sự đổi màu.

·        Sau 14 ngày thêm một lượng dung dịch chì acetat bão hòa trung tính bằng thể tích môi trường (vol/vol). Đối chứng là môi trường không cấy vi khuẩn.

·        Nếu có chuyển sang màu lục vàng và có ít chì acetat kết tủa là có khả năng đồng hóa tartrat (dương tính). Nếu màu vàng hay màu lục và có nhiều chì acetat kết tủa là xét nghiệm âm tính.

·        Phản ứng này dùng để phân biệt Salmonella zava (dương tính) và Salmonella paratyphi B (âm tính).

 

2.12.           Khả năng sinh trưởng với KCN

KCN có tác dụng ức chế Escherichia coli nhưng không ức chế Citrobacter freundi, vì thế thường được dùng để phân biệt 2 loài này.

·        Môi trường cơ sở:

Pepton               3 g

NaCl                  5 g

KH2PO4             0,22 g

K2HPO4             5,64 g

Nước cất           1000 ml.

pH = 7,6.

Khử trùng ở 115 0C trong 20 phút. Để môi trường vào tủ lạnh cho nguội đến 4 0C, thêm 15ml dung dịch KCN 0,5%, phân vào mỗi ống nghiệm 1ml (thao tác vô trùng); có thể  bảo quản được trong 2 tuần. Môi trường đối chứng không thêm dung dịch KCN.

·        Cấy vi khuẩn từ mới hoạt hoá (24 giờ) vào các môi trường đã chuẩn bị trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 4 ngày và quan sát sự chuyển màu của môi trường.

·        Nếu môi trường chuyển màu đỏ là sinh trưởng dương tính (Citrobacter freundii), nếu môi trường vẫn không màu là sinh trưởng âm tính (Escherichia coli).

 

3.                CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA:

3.1.   Xét nghiệm oxidaza

Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuản dựa trên hoạt tính cytochrom oxidaza

·        Pha dung dịch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD) 1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4 °C, sử dụng trong 2 tuần.

·        Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt.

·        Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc.

·        Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính.

·        Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả.

 

3.2.         Xét nghiệm catalaza

Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.

·        Chuẩn bị dung dịch H­2O2  nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.

·        Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính.

·        Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.

·        Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự.

Hình 3.1.         Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H2O2 của vi khuẩn có catalaza dương tính.

 

3.3.         Khả năng lên men/ôxy hóa glucoza

Có thể dùng một trong hai môi trường sau để làm thí nghiệm

·        Môi trường I:

Pepton                               2 g

NaCl                                   5 g

K2HPO4                              0,2 g

Glucoza                             10 g

Thạch                                 6 g

Dung dịch BTB 1%              3 ml    (pha trong một ít cồn 95%, sau đó mới thêm nước để thành dung dịch 1%)

Nước cất                            1000 ml.

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 20 phút.

·        Môi trường II:

NH4H2PO4                              0,5 g

K2HPO4                                  0,5 g

Cao men                                0,5 g

Glucoza                                 10 g

Thạch                                     5-6 g

Dung dịch BTB 1%                  3 ml   (pha như trên)

Nước cất                                1000 ml

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào ống nghiệm và khử trùng như trên.

·        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 h) cấy chích sâu vào môi trường bằng que cấy thẳng (mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 4 ống). Bịt kín 2 ống nút bông bằng vaselin-paraffin (lấy vaselin làm chảy ra, thêm 1/3 dầu paraffin) để cách ly với không khí. Ngoài ra lấy thêm 2 ống không cấy vi khuẩn làm đối chứng. Theo dõi kết quả sau 1,2,3,7 và 14 ngày.

·        Kết quả: - Nếu chỉ có ống không bịt kín sinh axit (chuyển màu vàng)

tức là vi khuẩn thuộc dạng ôxy hóa.

- Nếu cả ống không bịt và ống bịt kín đều sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn thuộc dạng lên men.

 

3.4.   Khả năng lên men đường, rượu

·     Môi trường:

Cao thịt                                   3 g

Pepton                                    10 g

NaCl                                        5 g

Chất chỉ thị màu Andrade*       10 ml

(hay dung dịch Xanh bromophenol 0,2%)

Nước cất                                  thêm đến 1000 ml

·        Bổ sung đường với nồng độ 0,5%. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml.

·        Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường.

* Cách pha chất chỉ thị màu Andrade:        

                  Fuchsin axit                  0,5 g

           NaOH 1M                  16 ml

               Nước cất                   100 ml

Nếu dung dịch có màu hồng, dùng NaOH 0,1 M (1-2 ml) để trung hòa cho đến khi mất màu.

Xanh bromophenol (BPB): 

2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày

·        Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục.

Có thể làm cách khác như sau:

·        Với vi khuẩn nói chung dùng môi trường I (xem mục 3.3), thay glucoza các đường khác hay rượu (nồng độ 1).

·        Với vi khuẩn sinh bào tử dùng môi trường sau:

(NH4)2HPO4                                 1 g

KCl                                               0,2 g

MgSO4                                          0,2 g

Cao men                                       0,2 g

Thạch                                            5-6 g

Đường hay rượu                            10 g

Nước cất                                       1000 ml

Dung dịch BTB 0,04%                    15 ml

pH = 7,0-7,2.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 30 phút.

·        Với vi khuẩn lactic dùng môi trường sau:

Pepton                                            5 g

Cao thịt                                           5 g

Cao men                                          5 g

Tween 80                                         0,5 ml

Thạch                                               5-6 g

Nước cất (hay nước máy)                 1000 ml

Dung dịch BTB 1,6%                          1,4 ml

pH = 6,8-7,0.

Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng tại 112 0C trong 30 phút.

·        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) cấy trích sâu vào môi trường thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1,3,5 ngày.

·        Nếu chỉ thị màu biến vàng là vi khuẩn có khả năng lên men sinh axit (phản ứng dương tính); nếu vẫn giữ màu lam là phản ứng âm tính.
 

3.5. Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red)

·        Môi trường:

Pepton                                              5 g

Glucoza                                            5 g

K2HPO4 hoặc­  NaCl                          5 g

Nước cất                                          1000 ml.

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 30 phút.

·        Thuốc thử:

Đỏ Methyl                                         0,1 g

Etanol 95%                                       300 ml

Nước cất                                           200 ml.

·        Cấy vi khuẩn vào môi trường (lặp lại 2 lần), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày (nếu kết quả âm tính cần kéo dài thêm thời gian). Với Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, đặt ống nuôi cấy ở 37 0C và kiểm tra sau 4 ngày.

·        Nhỏ 1 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính (màu đỏ ở pH 4,4; màu vàng ở pH 6,0).

Hình 3.2. Chất chỉ thị đỏ methyl chuyển màu khi tiếp xúc

với dịch nuôi cấy vi khuẩn lên men đường.

 

3.6.  Phản ứng  V.P. (Voges-Proskauer)

·        Môi trường: xem phần 3.5.

·        Thuốc thử:      

Creatin                 0,3% (hoặc để nguyên dạng tinh thể)

                    NaOH                 40%

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày.

·        Bổ sung NaOH 40% (bằng thể tích dịch nuôi cấy), sau đó nhỏ một ít dung dịch creatin (hoặc thêm một ít tinh thể), đợi khoảng 10 phút (có khi lâu hơn). Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính.

Cách khác:

·        Môi trường Clark-Lubs:

Pepton                                        3 g

K2HPO4                                      5 g

Glucoza                                      5 g

pH = 7,5.

·        Phản ứng V.P: nhỏ 5 giọt dung dịch alpha naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ ở 4 °C trước khi dùng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt là âm tính.

·        Phản ứng M.R: nhỏ 2-3 giọt dung dịch Đỏ methyl 0,5% (trong cồn 60%), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt hay không màu là âm tính.

Hình 3.3.         Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng V.P. và M.R.

 

3.7.   Phản ứng ONPG-aza (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase)

·      Môi trường:

ONPG                                                  0,6 g

Đệm phosphat 0,01M pH 7,5               100 ml

Dung dịch pepton 1% (pH 7,5)             300 ml.

(Hoà 0,6 g ONPG trong 100 ml dung dịch đệm, khử trùng bằng màng lọc, sau đó trộn với 300 ml dung dịch pepton đã khử trùng).

Bằng thao tác vô khuẩn phân môi trường vào các ống nghiệm nhỏ, bảo quản ở 4 °C trong vòng 1 năm.

·        Cắt những khoanh giấy lọc, khử trùng 112 °C, 30 phút.

·        Nhỏ vào mỗi khoanh giấy lọc một giọt dung dịch sau:

ONPG                                                  0,06 g

Na2HPO4.2H2O                                    0,017 g

Nước cất                                              10 ml

Làm khô ở 37 0C trong 24 giờ, bảo quản trong các ống nghiệm có nút xoáy ở nhiệt độ phòng.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (1 vòng que cấy) vào môi trường đã chuẩn bị như trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.

·        Ly tâm dịch nuôi cấy thu tế bào, làm dịch huyền phù đậm đặc trong 0,5 ml nước muối sinh lý.

·        Đưa khoanh giấy ONPG vào dịch huyền phù, giữ ở 35-37 0C trong 24 giờ.

Quan sát kết quả: màu vàng là phản ứng dương tính (Escherichia coli); không màu là âm tính (Salmonella paratyphi B).

 

 

           © http://vietsciences.free.fr , http://vietsciences.org , http://vietsciences2.free.fr   Nguyễn Lân Dũng