3.26.           Thủy phân Hippurat ; Phương pháp Yong & Thompson

(dùng khi định tên Streptococcus, Campylobacter và Gardnerella vaginalis):

·   Dung dịch cơ chất:

Na-Hippurat                                                   0,25 g

Nước cất                                                       25 ml

Khử trùng bằng màng lọc

·   Thuốc thử :

Ninhydrin                                                       3,5 g

Aceton-butanol (1:1 vol/vol)                         100 ml

Bảo quản trong lọ tối

·  Cấy 2 giọt huyền phù vi khuẩn vào dung dich cơ chất, giữ ở 37 ⁰C trong 1 giờ. Thêm 2 giọt thuốc thử, giữ 15 phút.

·    Phản ứng là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ tía (Campylobacter jejuni, Gardnerella vaginlis, Streptococcus agalactiae), phản ứng là âm tính nếu sau 15 phút chưa đổi màu (Campylobacter coli, Streptococcus agalactiae).

·   Chú ý: lượng vi khuẩn cấy phải thỏa đáng, thời gian ủ trước và sau khi thêm thuốc thử phải chuẩn xác. Tránh ánh sáng khi giữ thuốc thử.

Phương pháp Baird-Parker:

·   Môi trường:

Pepton tụy tạng                                    10 g

Cao thịt                                                1 g

Glucoza                                                1 g

NaH₂PO_4­                                             5 g

Na-Hyppurat                                        10 g

Nước cất                                              1000 ml

Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 ⁰C trong 30 phút.

·  Thuốc thử:

H₂SO₄ đặc                                            50 ml

Nước cất                                               50 ml

Đổ từ từ H₂SO₄ đặc vào nước cất

·  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường trên, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian 4-6 tuần.

·   Phản ứng xét nghiệm: trộn 1 ml dịch nuôi cấy với 1,5 ml thuốc thử. Phản ứng là dương tính khi xuất hiện tinh thể (do Hyppyrat được chuyển hoá thành Benzoin); không xuất hiện tinh thể là âm tính.

3.27.           Hoạt tính ADN-aza

Hoà tan các thành phần của môi trường bằng nhiệt, sau đó bổ sung ADN và Toluid-blue, trộn đều rồi phân vào bình. Khử trùng ở 121 ⁰C trong 30 phút, đổ thạch đĩa.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm trên đĩa thạch, nuôi ở điều kiện thích hợp trong 2 ngày.

·        Phản ứng là dương tính trong trường hợp quanh cụm cấy có vòng màu đỏ (dùng chủng Salmonella để làm đối chứng dương tính).

3.28.           Hoạt tính Phosphataza

·        Môi trường:

Làm nóng chảy môi trường thạch-nước thịt-pepton (đã khử trùng)

Thêm 1% Phenolphthalein diphosphat (khử trùng bằng màng lọc).

Đổ thạch đĩa.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá thành điểm trên thạch đĩa, nuôi ở điều kiện thích hợp trong 2 ngày.

·        Phản ứng xét nghiệm: lấy 0,1ml nước amonia phủ lên mặt thạch, sau 20 phút xem kết quả. Phản ứng là dương tính nếu khuẩn lạc chuyển màu đỏ phấn (Staphylococcus aureus); không chuyển màu là âm tính.

3.29.           Khả năng làm dịch hóa Gelatin

·        Môi trường:

Pepton                               5 g

Gelatin                               100-150 g

Nước cất                             1000 ml

pH = 7,2-7,4

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 ⁰C trong 20 phút.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ 2 ống không cấy làm đối chứng, nuôi ở 20 ⁰C trong thời gian 2,7,10,14,30 ngày.

·        Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 ⁰C trở xuống. Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái ổn định là phản ứng âm tính (không sinh gelatinaza); nếu một phần hay toàn bộ gelatin hóa lỏng thì là phản ứng dương tính. Nếu so với đối chứng âm tính thấy vi khuẩn đã mọc, gelatin chưa hóa lỏng nhưng bề mặt lõm xuống thì cũng vẫn coi là dương tính (mức độ dịch hóa thấp). Nếu vi khuẩn hoàn toàn không sinh trưởng thì có thể là không mọc được trên gelatin hoặc môi trường cơ sở chưa thích hợp.

·        Chú ý:

- Nếu vi khuẩn chỉ sinh trưởng ở nhiệt độ trên 20 ⁰C, lúc quan sát gelatin hoá lỏng cần đặt ống nuôi cấy một lúc vào nước lạnh rồi so sánh với đối chứng âm tính.

- Khử trùng ở nhiệt độ quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến kết quả, nên khử trùng ở 115 ⁰C trong 15 phút.

- Gelatin chất lượng không đều nhau, lượng dùng khó thống nhất, nên chọn nồng độ tạo đông tốt ở 20 ⁰C là được. Nên dùng thống nhất một loại gelatin cho toàn bộ thí nghiệm.

Hình 3.7.    Ví dụ minh hoạ kết quả kiểm tra khả năng làm dịch hoá gelatin (sinh gelatinaza), Escherichia coli- âm tính, Pseudomonas aeruginosa- dương tính.

3.30.           Hoạt tính Lipaza (với Tween 80)

·        Môi trường:

Pepton                                     10 g

NaCl                                         5 g

CaCl₂. 2H₂O                               0,1 g

Thạch                                        9 g

Nước cất                                    1000 ml

pH = 7,4.

Khử trùng ở 121 ⁰C trong 20 phút, để nguội đến 50 ⁰C rồi thêm Tween 80 đến nồng độ 1%, đổ thạch đĩa (có thể thay Tween 80 bằng dầu tributyrin).

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành vạch, nuôi trong 7 ngày, hàng ngày lấy ra quan sát.

·        Phản ứng là dương tính nếu quanh vết cấy có vạch trong, nếu không có thì là âm tính.

Hình 3.8.    Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng thử hoạt tính Lipaza: âm tính - Salmonella typhimurium (bên trái), dương tính - P. aeruginossa (bên phải).

3.31.           Hoạt tính Lipaza (với dầu ngô)

·        Môi trường:

Pepton                                                 10 g

Cao                                                      3 g

NaCl                                                     3 g

Thạch                                                    20 g

Xanh Victoria (Victoria Blue)

dung dịch 1:5000 trong nước                   100 ml

Dầu ngô                                                50 ml

Nước cất                                                900 ml.

Hoà tan các thành phần của môi trường (trừ dầu ngô) bằng đun nóng, sau đó bổ sung dầu ngô, khuấy đều bằng máy khuấy từ, chỉnh đến pH 7,8. Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 115 ⁰C trong 30 phút. Đặt thạch nghiêng hoặc đổ thạch đĩa, môi trường có màu đỏ nhạt.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.

·        Quan sát: phản ứng là dương tính khi môi trường chuyển sang màu lam, không chuyển màu là âm tính.

Hình 3.9.         Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng thử hoạt tính lipaza với dầu ngô.

3.32.           Hoạt tính Lecithinaza

·        Trộn lòng đỏ trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý (thao tác vô trùng) tạo thành dịch huyền phù.

·        Lấy ra 10 ml dịch huyền phù trên hòa tan vào môi trường thạch-nước thịt-pepton vừa khử trùng, để nguội đến 50-55 ⁰C rồi đổ đĩa Petri.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm trên đĩa thạch, mỗi điểm đường kính khoảng 2-3mm. Cấy 5-7 chủng trên một đĩa. Với vi khuẩn kỵ khí có thể đậy lá kính mỏng (lamelle) lên vết cấy, tuy nhiên tốt nhất là đưa vào tủ nuôi kỵ khí.

·        Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 18-24 giờ, một số chủng (như chi Bacillus) cần thời gian lâu hơn (48 giờ) và quan sát biến đổi của môi trường thạch.

·        Nếu xung quang và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (Lecithin được chuyển hoá thành lipid do vi khuẩn sinh men lecithinaza).

·        Chú ý: khi trộn dịch huyền phù lòng đỏ trứng vào môi trường thạch không nên tiến hành ở nhiệt độ quá cao vì sẽ làm ngưng kết lecithin có trong lòng đỏ trứng.

Hình 3.10.       Khả năng phân hủy Lecithin của Clostridium

3.33. Khả năng sản sinh H₂S

Phương pháp giải giấy

·        Môi trường:

Pepton                                                              10 g

NaCl                                                                  5 g

Cao thịt                                                             10 g

Cystein                                                              0,5 g

Nước cất                                                           1000 ml

pH = 7,0-7,4

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 ⁰C trong 20-30 phút.

·        Cắt giấy lọc thành dải rộng 0,5-1cm, độ dài tùy thuộc vào ống nghiệm và độ cao của môi trường. Tẩm vào giấy dung dịch Chì-acetat, sấy khô giấy trong tủ sấy đặt trong hộp Petri và khử trùng.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ). Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì-acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài đến nút bông nhưng không chạm vào môi trường. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày thì lấy ra quan sát. Nếu giấy biến đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu thì là âm tính.

·        Chú ý: phương pháp này rất mẫn cảm, không thích hợp đối với trực khuẩn đường ruột. Không đặt giấy lọc tẩm chì-acetat gần mặt môi trường quá để tránh bị hút ẩm, nhưng cũng không nên đặt cách xa quá. Ngoài ống đối chứng không cấy vi khuẩn nên lấy chủng vi khuẩn đã biết là âm tính để làm đối chứng.

Phương pháp đối với Trực khuẩn đường ruột

·        Môi trường:

Cao thịt                                7,5 g

Pepton                                  10 g

NaCl                                     5 g

Gelatin                                  100-120 g (hay thạch      15 g)

Dung dịch FeCl_2­ 10%              5 ml (khử trùng riêng bằng màng lọc)

Nước cất                                 1000 ml

pH = 7,0

Khử trùng ở 112 ⁰C trong 20 phút, bổ sung dung dịch FeCl₂ (đã khử trùng)  vào khi thạch hay gelatin chưa đông. Phân vào các ống nghiệm vô khuẩn (4-5 ml), ngay lập tức nhúng vào nước lạnh cho đông lại.

·        Cấy chích sâu vi khuẩn vào các ống, nuôi ở 30 ⁰C trong 1,3,7 ngày. Nếu môi trường chuyển thành màu đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu là âm tính.

·        Chú ý: phương pháp này dùng khi cần định tên vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Có thể dùng FeSO­₄ thay thế cho FeCl₂. Nếu nuôi cấy ở 20 ⁰C có thể dùng kết hợp để xác định gelatinaza.

3.34. Khả năng phân giải sữa (Litmus Milk Reaction)

·        Môi trường: sữa tươi đun sôi, để lạnh qua đêm, ly tâm và hớt bỏ bơ ở lớp trên, phần dưới là sữa không chứa lipid. Có thể dùng sữa bột đã loại chất béo (hoà tan 100 g sữa bột với 1000 ml nước).

·        Thuốc thử Litmus:

hoà tan 2,5 g Litmus trong 100 ml nước cất, lọc bằng giấy lọc, để qua đêm mới sử dụng. Có thể bảo quản lâu.

·        Môi trường sữa –Litmus:

Dung dịch Litmus 2,5%                  4 ml

              Sữa đã loại bơ                           1000 ml

    Môi trường có màu đỏ tía.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 ml), khử trùng gián đoạn hay khử trùng ở 112 ⁰C trong 20-30 phút.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp, sau 1,3,5,7,14 ngày lấy ra quan sát.

·        Dựa vào biến đổi của môi trường mà có những kết luận như sau:

Môi trường chuyển thành màu trắng ® phản ứng khử Litmus

Môi trường trở nên trong ® phản ứng peptôn hoá

Môi trường chuyển mầu đỏ ® phản ứng sinh acid

Môi trường chuyển màu xanh lam ® phản ứng sinh kiềm

Môi trường chuyển màu đỏ, sữa ngưng kết ® sinh acid và ngưng kết

Ngưng kết do men: không chuyển màu hoặc có màu lam, sữa vón cục và ngưng kết

·        Chú ý: tốt nhất nên dùng sữa tươi, không cần điều chỉnh pH.

3.35.           Khả năng oxy hóa Gluconat

·        Đệm Kali phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2:

                                      A) KH₂PO₄                                       9,078 g/L

B) K₂HPO₄.12H₂O                            23,876g/L

Trộn 3 ml dung dịch A với 7 ml dung dịch B để có dung dịch đệm phosphat  1/15 mol/L, pH 7,2

·        Thuốc thử Feling:

Dung dịch A:     CuSO₄ tinh thể                       34,64 g

Nước cất                                thêm tới 500 ml

Dung dịch B:     Na-Tartrat                             173 g

KOH                                      125 g

Nước cất                                thêm tới 500 ml

Trước khi dùng trộn hai dung dịch A và B theo tỷ lệ 1:1 (vol/vol), sử dụng trong ngày.

·        Chuẩn bị dung dịch gluconat 1% trong đệm phosphat pH 7,2, phân vào các ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Khử trùng 112 ⁰C trong 30 phút.

·        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) để tạo dịch huyền phù đậm đặc trong đệm phosphat, giữ ở 30 ⁰C qua đêm.

·        Thêm vào mỗi ống 0,5 ml thuốc thử Feling, đặt trong bình cách thủy sôi 10 phút.

·        Kết quả: nếu dịch huyền phù chuyển từ màu lam sang màu vàng lục, lục da cam hoặc có kết tủa đỏ là phản ứng dương tính; nếu không đổi màu là âm tính.

·        Chú ý: nếu dùng gluconat canxi thì dễ tạo kết tủa với gốc phosphat, tuy nhiên không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.

3.36.           Khả năng oxy hóa Etanol

·        Với vi khuẩn Acetobacter dùng môi trường sau:

Cao men                                             10 g

Nước máy                                           1000 ml

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%            20 ml.

 pH = 6,8-7,0

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 121 ⁰C trong 20 phút. Lúc sử dụng thêm ethanol vào mỗi ống ở nồng độ khoảng 2-10% (vol/vol)

·        Với các vi khuẩn khác: dùng môi trường như trong thí nghiệm oxy hóa/lên men, thay đường bằng etanol với nồng độ 1%. Có thể không cần thạch.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, nuôi 1,3,7,14 ngày trong điều kiện thích hợp

·        Kết quả: nếu môi trường chuyển màu vàng (do sinh acid) thì là dương tính, không đổi màu là âm tính.

Phương pháp khác (dùng để phân lập và kiểm định Acetobacter):

·        Thêm vào các môi trường nói trên 2% thạch và 1% CaCO₃; nồng độ etanol cuối cùng là 2%; không thêm chỉ thị màu. Đổ thạch đĩa.

·        Cấy vi khuẩn trên thạch đĩa, nuôi 3, 7, 14 ngày ở điều kiện thích hợp.

·        Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải trong là kết quả dương tính, nếu không là âm tính (Acetobacter lúc đầu phân giải CaCO₃ nên tạo vòng trong, nhưng sau đó acetat canxi tạo ra bị oxy hóa tiếp chuyển thành CaCO₃ vòng trong chuyển màu trắng sữa sáng do acid acetic đã bị oxy hóa).

3.37. Khả năng oxy hóa acid acetic

·        Môi trường:

Cao men                                                 10 g

Ca-Acetat                                                10 g

Thạch                                                      20 g

Nước máy                                               1000 ml

pH 7,0-7,2

Phân môi trường vào bình tam giác hoặc các ống nghiệm lớn để khử trùng, đổ thạch đĩa hoặc làm ống thạch nghiêng.

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi 3-5 ngày ở điều kiện thích hợp

·        Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat đã bị oxy hóa, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không thì là âm tính.

3.38.           Xác định Indol-Pyruvic acid (IPA)

·        Môi trường SIM:

Cao thịt                                                 3 g

Pepton                                                   30 g

Na₂S₂O₃.5H₂O                                        0,05 g

Cystin hydrochlorid                                  0,2 g

Ammonium-ferric-citrat                             0,5 g

Thạch                                                     4 g

Nước cất                                                1000 ml

Hoà tan các thành phần môi trường trong nồi cách thủy, chỉnh pH đến 7,4, phân vào các ống nghiệm nhỏ, khử trùng ở 121 ⁰C trong 15 phút, đặt ống thạch đứng.

·        Thuốc thử Kovac (có thể mua sẵn hoặc tự pha):

p-dimethyl aminobenzaldehyd                  8 g

Etanol                                                   760 ml

HCl đặc                                                  160 ml

·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường SIM, nuôi ở 30⁰C trong 24 giờ.

·        Kết quả: nếu phần trên của môi trường chuyển màu nâu là phản ứng IPA dương tính, nếu không là phản ứng âm tính.

·        Sau đó nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào và quan sát. Nếu trên mặt thạch xuất hiện màu đỏ đào là phản ứng Indol dương tính.

Hình 3.11. Ví dụ minh hoạ phản ứng Indol dương tính.

Tài liệu tham khảo :

1. James G. Cappuccino & Natalie Sherman, 2002.  Microbiology: a Laboratory Manual, 6^th ed. Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA.

2. Hans Trueper & Karl-Heinz Schleifer, 2000. Prokaryote Characterization and Identification. In: Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H. & Stackebrandt E. (ed.). The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community. Springer-Verlag, New York.

3. Vũ Thị Minh Đức, 1998. Thực tập Vi sinh vật. NXB GD, ĐHTH Hà Nội.

4. Krieg N.R. & Holt J.G. (ed.) 1984. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA.

5. Đông Tú Châu et al.,2001, Thường kiến tế khuẩn hệ thống giám định thủ sách, Khoa học xuất bản xã (Trung văn).