Micro RNA (miRNA) và Phương Pháp Trị Liêu Bệnh Ung Thư

Vietsciences- Vũ Mạnh Huỳnh    25/06/2008

 

Những bài cùng tác giả


Lịch sử, tiến trình sinh sản, và phận sự cua miRNA trong sinh hoc:

miRNA là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotide đã được phát hiện từ lâu trong di truyền vi sinh vật, động vật, thực vật và người. Nhưng mãi đến năm 1993, lần đầu tiên, việc tách ly và phân tích định tính miRNA lin-4 và let-7 của sâu Caenorhabditis elegans, một loại sâu sinh sống ở trong đất, rau đậu bị hư thối… mới được hoàn tất.
Hai miRNA này giữ vai trò quan trọng trong việc điều tiết ở thời kỳ phát triển nhộng (larval development) của loại sâu đất này. Mặc dầu công trình nghiên cứu về vai trò (phận sự) của miRNA trong tế bào chưa được hoàn toàn thành công, nhưng các chuyên gia đã có bằng chứng cho thấy sự hiện diện của miRNA có liên quan đến sự tăng trưởng của mô và tế bào. Khác với RNA thônng tin (mRNA – messenger RNA), miRNA không tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein, nên đã được đặt tên là non-protein coding RNA (RNA không mã hoá protein). Trong các chương trình nghiên cứu y dược, các chuyên gia trong ngành thường chỉ chú trọng đến cách tổng hợp các hóa chất, peptide nhân tạo có khả năng hạn chế, gây trở ngại, tàn phá hoặc làm triệt tiêu cơ chế phát sinh protein, hay tác động đến chính protein có hại cho nông nghiệp và nhân loại. Cũng vì không giữ vai trò trong sinh tổng hợp protein cho nên miRNA đã bị lãng quên trong quá trình nghiên cứu y dược. Trong quá trình sinh học, miRNA Gene đã được tác đông bởi enzyme RNA Polymerase II, chuyển hoán và tạo ra microRNA nguyên thủy, được gọi là pri-miRNẠ. Đây là chuỗi RNA dài hàng nghìn base, và mang đầu 5'-CAP, và đầu 3' là gốc đa A (Poly-A, AAAA...).

Pri-miRNAs chứa đựng ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc (Hairpin), mỗi vòng dài khoảng ~70 nucleotides. Cũng như tất cả các RNA khác (kể cả mRNA), pri-miRNA bị tác động cắt đoạn bởi hai enzymes là DROSHA ở trong nhân và DICER ở trong tế bào chất (Cytoplasm). Sự cắt đoạn này tạo ra các đoạn miRNA có hoạt tính tương tự như siRNA (small interfering RNA). MiRNA kết hợp với RNA Interference (RNAi) dưới sự hiện diện của phức hợp RISC (RNA-induced Silencing Complex) sẽ tác động lên một phần của mRNA dưới dạng kết hợp cặp base (Base-pairing) để tiết chế việc tiếp tục sinh sản hay phân giải mRNA đã phát sinh trong tế bào. Sự chuyển hoán trong quá trình sinh học tạo ra miRNA và quá trình tác động của miRNA lên mRNA được mô tả trong Hình 1.

 


 

Hình 1: Tiến trình phát sinh và cơ chế phản ứng của microRNA trong sinh thể, nội dung của tiến trình được tóm tắt như sau:

1. miRNA có chiều dài khoảng 19-24 nucleotides, được tạo ra (sinh sản) từ tác động cắt đoạn các Hairpin trong pre-miRNA, dài khoảng 60 - 110 nucleotides, bởi hai enzymes DROSHA, và DICER.

2. Gần 70% các miRNA được phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình tạo (sinh sản) mRNAs và các RNAs không sinh tổng hợp proteịn. Tuy nhiên, số còn lại được phát sinh độc lập, không phụ thuộc vào quá trình trên. Cho đến nay, các chuyên gia chưa xác định được chức năng của các RNA này

3. miRNA có thể điều tiết sự phân giải mRNA với sự hiện diện của phức hợp RISC (RISC complex), trong trường hợp bổ sung hoàn toàn (Perfect Complementary), quá trình này được gọi là RNAi.

4. Trong trường hợp bổ sung không hoàn toàn (imperfect complementary) với 3'UTR của mRNA, sự chuyển hoán sẽ bị tiết giảm và bị chậm bớt.

5. miRNA có thể tác động lên gần 200 phiên bản RNA (RNA transcripts) và nhiều miRNA có thể tác động ảnh hưởng điều tiết lên một Gene mã hoá protein (protein-coding Gene).

6. Các chuyên gia ước lượng rằng hơn 50% gene mã hóa protein của người đang bị kiểm soát bởi miRNA


Cơ chế của RNA-Antisense để làm trở ngại tiến trình miRNA:

Vì miRNAs đã không giữ vai trò trực tiếp trong quá trình tổng hợp protein, cho nên các công trình nghiên cứu về miRNA đã không được quan tâm. Khoảng 15 năm gần đây, các chuyên gia đã đề ra công trình nghiên cứu mới, nhắm đến các giai đoạn trước khi sinh sản ra mRNA, ứng dụng song song với việc triển khai của ngành DNA/RNA Antisense. Kết quả là họ đã tim thấy được hoạt tính kháng ung thư trong các phòng thí nghiệm cấy mô, các hoạt tính này cho thấy rõ được ứng dụng hữu hiệu của ngành Antisense trong các phòng thí nghiệm.




Hammond S. M., TRENDS in Molecular Medicine, 12, 3, 99-101, 2006

 


Hinh 2: Tiến trình phát sinh miRNA và thời điểm có sự tác động của miRNA Antisense Inhibitors:

 miRNA được sinh sản bởi RNA Polymerase II, sau khi đươc tác động bởi DROSHA trong nhân, vòng RNA (có cấu tạo Stem-Loop), là tiền micro RNA, được gọi la pre-miRNA, được thẩm thấu sang tế bào chất, và ở đó sẽ bị cắt bởi DICER thành miRNA 22 nucleotides. Trong hình này, nếu miRNA kết hợp với RNA Antisense nhân tạo Antagomir, có khả năng kết hợp mạnh hơn mRNA theo chiều mũi tên đỏ) thì sẽ sinh ra chuỗi RNA nguyên thủy, và quá trình trở lại từ đầu.

Mục đích của việc khảo cứu Antisense RNA trong những năm gần đây:

Hiện nay có khoảng 4167 miRNA đã được đăng ký, lấy từ sinh vật như thảo mộc, vi sinh vật, động vật chân khớp (arthropods) và đông vật có xương sống (vertebrates) như chim, cá, người. Cho đến nay các chuyên gia đã tách ly và định cấu trúc của hơn một nghìn miRNAs cho người, và trong số đó có đến 474 miRNA (theo Hammond) đã được định tính và tất cả các chi tiết được ghi nhận trong mạng http://microrna.sanger.ac.uk . Như vậy chúng ta có thể suy luận rằng miRNA chính là nguồn tiết chế quá trình sinh hoc của mRNA dựa trên sự kết hợp cặp đôi base (Base-paring) giữa nó, miRNA và mRNA. Vấn đề các chuyên gia đang quan tâm là làm sao có thể ức chế quá trình kết hợp này. Các chuyên gia đã thành công trong việc dùng các RNA Antisense nhân tạo chứa những gốc có vai trò làm tăng hoạt tính kết hợp bổ sung cặp base (base-paring complementary) của RNA. Các RNA Antisense này sẽ phải có cấu trúc giống như mRNA về cặp base (base-pairing) và phải có hoạt tính kết hợp cao hơn mRNA để có thể tác động lên miRNA trước khi để miRNA tác động lên mRNA. Các RNA Antisense nhân tạo đối với miRNA này sẽ có thể làm cản trở (trở ngại) sự tiến triển của quá trình này dựa trên cơ chế tác động của RNA Antisense.

Nhằm gia tăng thời gian sống (time-life), gia tăng tính bền nhiệt (thermal stability), gia tăng dung điểm (melting temperature) và họat tinh của các RNA nhân tạo, các chuyên gia Antisense đã dùng các phương pháp sau đây:

1. Biến đổi đầu 3' và 5' (3'- and 5'-ends modification) làm tăng thời gian sống (tính sinh tồn) của RNA nhân tạo: Thông thường các enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3' dến đầu 5', nhưng cũng có enzyme cắt từ đầu 5' đến đầu 3'. Để bảo vệ hai đầu của RNA nhân tạo tránh khỏi phản ứng của Enzyme, người ta thường thay thế hai gốc nối phos-phát P=O ở hai đầu thành phosphorothioate (P=S) hoặc phosphoramidate (P-N) hay bằng các liên kết amine (amine-linker) ngắn hay các hóa chất thông thường như Cholesterol, Cyclodextrin. Các hóa chất này có thể làm giảm hiệu năng phân giải của Enzyme và làm tăng thời gian sống của RNA nhân tạo trong quá trình sinh học.

2. Dùng các hóa chất có tính kị nước (hydrophobic), ưa nước (hydrophilic) hay polyamine ở đầu 3' hay đầu 5' để làm gia tăng tính thẩm thấu qua màng tế bào và màng nhân tế bào: nhiều thi nghiệm cho thấy rằng các hóa chất có tính kị nước cao như cholesterol, pyrene hay ưa nước cao như cyclodextrin và các đa amine (polyamine)....đã giúp việc chuyển DNA/RNA qua màng của tế bào hữu hiệu hơn.

3. Dùng các RNA nhân tạo với sự biến đổi các gốc 2'-Oxy để làm gia tăng tính bền nhiệt (Thermal Stability, melting temperature) của RNA nhân tạo: 2'-Omethyl, 2'-amino, 2'-O-Alkyl, 2'-Fluoro, LNA (Lock Nucleic Acid).

Các nỗ lực nghiên cứu hóa học tổng hợp nhằm sản xuất các nhóm oligonucleotides (DNA/RNA) nhân tạo có hoạt tính có thể dùng trong y dược đang là một đề tài sốt dẻo tại các nước phát triển. Trong 25 năm qua, các chuyên gia trong ngành Antisense Oligonucleotides DNA/RNA đã đạt được một số thành quả ứng dụng đáng kể. Đây chính là nhân tố kích thích việc nghiên cứu trong ngành này trong những năm gần đây. Để tìm ra loại oligonucleotides DNA/RNA nhân tạo nào đó có nhiều gốc biến đổi hóa học mà vẫn có thể hòa tan dễ dàng trong dung dich nước, có thể bền vững trong những phản ứng phân giải của Enzymes, có thể có tính kết hợp base-pairing rất chặt chẽ với các Oligonucleotides DNA/RNA thiên nhiên và nhất là với các gốc hóa học mới này, oligonucleotides vẫn sẽ cho thấy được đặc tính sinh học của nó ứng dụng được trong y dược. Mới đây, LNA (Lock Nucleic Acid, Hình 3), với cấu trúc hóa học được biến đổi nhưng vẫn mang đủ điều kiện như một RNA nucleoside. LNA Oligonucleotides sẽ có đặc điểm là xương sống phos-phat LNA sẽ không bị dễ dàng phân giải hoàn toàn, hay biến đổi từ 3'-Oxy, sang 2'-Oxy ở trong các môi trường dung dịch với pH>7.0 và pH<7.0, các oligonucleotides thuộc loại này sẽ rất vững bền trước phản ứng của Enzymes, và có tính bền nhiệt (Thermal Stability, Tm) khi có kết hợp base-pairing với các RNA thiên nhiên.



Hình 3: LNA với A, G, C, U là các base.

 

Cấu trúc của LNA ở trên cho thấy LNA mang một cầu nối methylene từ 2'-Oxy đến 4'-Carbon, đã biến nucleoside RNA này thành cấu tạo vòng kép. Và cũng vì cầu nối methylene này mà LNA oligonucleotide sẽ không ở vị trí tự do như RNA thường. Kết quả nghiên cứu của việc áp dụng biến đổi oligonucleotides thường thành oligonucleotides mang 2 vòng (vòng kép như trường hợp LNA) hay 3 vòng (ở gốc vòng Pentafuranose (Carbohydrate), đều gia tăng tính bền nhiệt hay nhiệt dung (Thermal Stability or melting temperature, Tm, increased). LNA oligonucleotide kết hợp với DNA, hay với RNA sẽ có dung điểm tăng lên từ +3˚C tới +4˚C so với RNA thường kết hợp với DNA hay RNA. Cũng vì đặc tính của cầu nối này mà các chuyên gia đã quan sát được sự gia tăng hoạt tính kháng sinh của các nucleoside có chứa vòng kép, thí dụ như Locked AZT-triphosphate, có hoạt tính mạnh hơn AZT triphosphate thuờng (Jesper Wengel et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans.1, 1407-1414, 1999).
 



 

Hình 4: Pentafuranose của LNA (b) bị khóa không còn có dạng C2'-endo (S-type), hay C3'-endo (N-type) như trong cấu trúc của nucleotide thường (a).
 

Wengel et al quan sát thấy LNA không còn có dạng C2'-endo (S-type), hay C3'-endo (N-type) như trong cấu trúc của nucleotide thường (a). Mà LNA còn có cấu tạo lập thể quang hóa học vì mang vòng kép ở Pentafuranose, chỉ tồn tại dưới một dạng (b). như được mô tả trong Hình 4 trên. Cấu trúc lập thể của hai LNA oligonucleotides được diễn tả dưới đây (Wengel et al. TRENDS in Biotechnology 21, 2, 74-81, 2003).


Hình 5: LNA Với cấu trúc β-D, LNA với cấu trúc α-L


Các chuyên gia đã triển khai LNA rộng rãi hơn, bằng cách biến đổi cấu trúc sẵn có của LNA nguyên thủy để tìm cách gia tăng hoạt tính y dược của oligonucleotides, bằng cách thêm các gốc mới như methyl, amino, linkers..., hay các nguyên tố khác như Sulphur, Nitrogen, Fluorine…, hay thay đổi cấu trúc từ β-D- (Hình 5) sang β-L-cấu trúc, hai cấu trúc này có sự đối xứng qua gương phẳng (Stereoisomer), hay từ α-LNA sang α-L-LNA, hay sang xylo-LNA . Các chuyên gia vẫn quan sát thấy sự gia tăng hoạt tính sinh tồn va` ổn định nhiêt, cho cả các trường hợp LNA, α-L-LNA (Hình 5), và các LNA có cấu trúc liên quan khác, được mô tả trong Hình 6 dưới đây.


Hình 6: Các cấu trúc của các LNA, với các gốc biến đổi đã được tổng hợp, và thử nghiệm.

 

Tổng hợp và tinh chế RNA Antisense:

 

Các chuyên gia cũng đang cố gắng trong quá trình sản suất dùng máy tổng hợp DNA/RNA để sản xuất 400 umole Antisense RNA cho miRNA, là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotides để làm thuốc, cho ra tương đương với 10 gram sản phẩm thô. Tổng hợp RNA khó hơn việc tổng hợp DNA vì RNA mang gốc OH ở vị trí carbon 2', tương đối gần với trung tâm phản ứng phosphat ở vị trí carbon 3' ngay bên cạnh, trên cấu trúc vòng Pentofuranose của nucleotide. Hơn thế nữa gốc OH này lại phải đươc bảo vệ bởi nhóm hóa chất Alkylsilyl (thường là t-butyl-dimethyl silyl). Gốc bảo vệ này sẽ che chở cho RNA được toàn vẹn trong các quá trình hậu tổng hơp.
Vì RNA nguyên thủy sẽ bị dễ dàng cắt ra thành nucleoside trong dung dịch có điều kiện pH cao (pH > 7) và xương sống oligonucleotides dễ bị chuyển hoán từ 3'-Oxy sang 2'-Oxy trong dung dịch có điều kiện pH thấp (pH < 7), khi đó các gốc bảo vệ sylyl không còn tồn tại trên RNA oligonucleotides.
Các chuyên gia dùng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy sản phẩm từ máy tổng hợp (synthesizer) chứa nhiều đoạn N-minus. Chất N-minus này sinh ra sau mỗi vòng phản ứng của máy vì hiệu ứng của mỗi vòng phản ứng (~98%) thấp hơn so với hiệu ứng nhận được trong việc tổng hợp DNA (99.5%). Họ đã dùng HPLC để tinh chế, tuy nhiên các chuyên gia chỉ lấy được sản phẩm với độ tinh chế là 88% cho lần tinh chế bằng HPLC. Để đạt được tiêu chuẩn do Bộ Y Tế Hoa Kỳ, US-FDA đề ra là 98+% cho Antisense, các chuyên gia phải dùng phương pháp tinh chế kép bằng HPLC (Double Purification Process), hoặc phải chấp nhận hiệu suất tinh chế thấp khoảng 5-10%.
Giá thành nguyên liệu sản xuất Antisense:
Việc nhắm đến tác dụng làm trở ngại RNAs không đóng vai trò liên quan trực tiếp đến quá trình của protein là một hướng nghiên cứu y dược mới, hứa hẹn một loại thuốc có cơ chế mới, sẽ chữa trị một cách hiệu quả cho các bệnh di truyền hiểm nghèo.
Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm (in vitro) gần đây cho thấy LNA đã ức chế được sự tăng trưởng của nấm Candida albicans khi sử dụng hai đoạn LNA dài 8 nucleotide và LNA/DNA dài 12 Nucleotide với nồng độ thấp là 150 nanomole và 30 nanomole tương ứng.
LNA không những đã được dùng hữu hiệu trong việc thử nghiệm kháng vi khuẩn, kháng ung thư, mà LNA còn có tác dụng gia tăng hoạt tính trong các thuốc chẩn bệnh. Giá thành của nguyên liệu phosphoramidite A,C,G,T(U) để sản xuất DNA, RNA, LNA đã được các hãng sản xuất cho biết như sau:DNA phosphoramidites giá là 5 USD/gam, 2'Omethyl RNA giá là 35 USD/gam và RNA giá khoảng 80 USD/gam nếu mua với một lượng là hàng trăm ký lô gam một lần. Giá này chỉ được dùng để bán hóa chất cho các công ty lớn đang sản xuất Antisense. Các công ty hóa chất này thường bán với giá gấp đôi với giá vừa nêu ra cho những công ty chỉ đặt mua khoảng 50 ký lô gram một lần. LNA là hóa chất mới được tổng hợp phải trải qua nhiều quá trình hóa học cần thiết và các công ty hóa chất chưa có quy trình sản xuất thích hợp với một lượng là 100 gam, vì thế nếu đặt hàng là 5 gam thì giá là 10,000 USD/gam.

Kết Luận:

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu cho thấy miRNA có liên quan đến sự phát triển của tế bào ung thư như C. elegans (lin-4) và Drosophila. Cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy việc dùng Antisense RNA tương ứng với các miRNA này đã làm giảm được sự tăng trưởng của các tế bào ung thư này, như tế bào ung thư Hela và 549. Trên 50% các miRNA đã được tách ly và định tính từ các trung tâm phát bệnh ung thư. Zhang và cộng sự đã dùng dãy phân giải cao (high resolution array), phép lai di truyền so sánh (Comparative Genomic Hybridization, CGH) để phân tích cho thấy rằng trong tổng số 41 miRNA Genes có khoảng 15% Genes đã được kiểm tra cho thấy có các bản sao (copies) trong 3 loại ung thư chính: ung thư ngực (Breast Cancer, ung thư tử cung (cervical cancer) và ung thư da (melanoma). Ngành DNA Antisense đã được bắt đầu hơn 20 năm qua và hiện đang chuyển sang một giai đoạn mới với siRNA, RNAi và miRNA. Hy vọng Antisense RNA sẽ đưa chúng ta đến một giai đoạn công nghệ cao để tìm ra phương pháp tri liệu các bệnh nan giải như bệnh ung thư.

Vũ Mạnh Huỳnh
Tiến Sĩ Hóa Học


     ©  http://vietsciences.free.fr  và http://vietsciences.org Vũ Mạnh Huỳnh