Vào tháng 9 năm 1954, Louis Pasteur được Bộ Trưởng Giáo Dục Pháp bổ nhiệm làm Giáo Sư Hóa Học và Khoa Trưởng Khoa Học tại Đại Học Lille. Đây là một ngôi trường mới được thành lập tại trung tâm kỹ nghệ rất giàu có thuộc miền bắc của nước Pháp. Louis Pasteur với tuổi 32, đã được giao trọng trách là giáo dục các sinh viên làm sao đáp ứng được các nhu cầu thực tế của địa phương. Giáo Sư Pasteur đã khởi đầu một quan niệm giáo dục rất tiến bộ đối với thời bấy giờ, đó là lập ra các lớp học buổi tối dành cho các công nhân trẻ của thành phố kỹ nghệ, đồng thời ông cũng dẫn các sinh viên ban ngày đi thăm viếng các nông trại và các nhà máy lớn. Pasteur đã từng nói: "không có hai loại Khoa Học mà chỉ có Khoa Học và các áp dụng của Khoa Học. Hai thứ này liên kết với nhau như trái cây mọc ra từ cành cây".
 Tại vùng Lille, có rất nhiều nhà máy nấu rượu. Người ta đã cho men vào nước nho và sau tiến trình lên men, nước nho trở thành rượu chát. Nhưng vào thời kỳ đó, không ai biết rõ tại sao đã có những biến đổi này. Các nhà khoa học chỉ nói về tiến trình lên men là "lạ lùng và còn bí ẩn ".
 Vào một ngày mùa hè năm 1856, ông Bigo là chủ của một lò nấu rượu đã tới trường đại học, thăm viếng Giáo Sư Pasteur. Ông Bigo đã trình bầy rằng một dung dịch củ cải đường thường được chuyển thành rượu nhưng lần này, nó đã trở thành dấm chua. Các nhà sản xuất rượu khác cũng báo cáo cùng một trở ngại và đây là một điều xấu cho nền kỹ nghệ trong vùng bởi vì sự lên men dấm đã gây thiệt hại hàng ngàn quan tiền trong một ngày. Không ai biết rõ nguyên do đã sinh ra sự lên men rượu, tại sao rượu trở thành dấm chua. Ông Bigo hi vọng rằng vị Giáo Sư Pasteur dạy người con trai của ông, sẽ cho các lời khuyên. Vì vậy Louis Pasteur đã tới thăm nhà máy nấu rượu và đã lấy các mẫu dung dịch của cả loại tốt lẫn loại đã bị hư hỏng. Qua kính hiển vi, Louis Pasteur nhận thấy rằng các tế bào men rượu (ferments) ở dạng hình tròn rất nhỏ, nhưng trong dung dịch bị hư hỏng, các tế bào tròn đó đã bị các tế bào hình que lấn át. Louis Pasteur gọi các tế bào men rượu là "wee germs" (vi trùng) (sau này được gọi là các vi sinh vật = microorganisms). Ông nhớ lại công trình khảo cứu của nhà khoa học Charles Cagniard-Latour theo đó các tế bào men rượu đã sinh sản bằng cách mọc mầm (budding). Pasteur đặt giả thuyết rằng nếu các tế bào này sinh sản được thì chúng có sự sống và đã sống nhờ đường trong dung dịch củ cải đường và biến dung dịch này thành rượu. Louis Pasteur đã cấy men trong nhiều loại dung dịch đường và đã nhìn thấy qua kính hiển vi các tế bào men rượu sinh sôi nẩy nở, ngay cả trong một môi trường nhân tạo thiếu khí oxygen, quan niệm này trở thành hiệu ứng Pasteur (the Pasteur effect).
Khi nghiên cứu về dung dịch sữa là thứ dễ bị hư hỏng, Louis Pasteur cũng thấy sữa trở thành chua khi có nhiều loại tế bào hình que, loại đã thấy trong dung dịch củ cải đường bị hư hỏng của ông Bigo. Do sự khám phá của mình, Giáo Sư Pasteur đã khuyên các nhà nấu rượu nên dùng kính hiển vi để khám xét các thùng rượu đang lên men.
Năm 1857, sau hai năm khảo cứu về dung chất củ cải đường, ông Pasteur phổ biến một báo cáo về sự lên men theo đó có hai loại men, một loại có ích đã biến dung dịch củ cải đường thành rượu và một loại có hại, hình que, chỉ dài bằng 0.001 mm.
Báo cáo về sự lên men do các vi sinh vật gây nên, đã tạo ra một cơn bão phản đối trong giới khoa học vì một số nhà khoa học thời đó tin rằng sự lên men là do phản ứng giữa các chất thành phần. Nhiều nhân viên của Hàn Lâm Viện cũng không chấp nhận các chứng cớ nêu ra. Tuy thế, Giáo Sư Louis Pasteur vẫn tiếp tục nghiên cứu.
Cuối năm 1857, Louis Pasteur được gọi về Trường Cao Đẳng Sư Phạm tại thủ đô Paris và làm giám đốc khảo cứu khoa học. Vào thời gian này, Louis Pasteur đã gặp các khó khăn mà các nhà khoa học đương thời cùng phải chịu đựng: phòng khảo cứu không được trang bị đầy đủ dụng cụ, không có ngân khoản và các tiện nghi khác. Ông Pasteur phải dùng tiền riêng của mình để biến đổi hai phòng trên lầu của nhà trường thành một nơi khảo cứu. Louis Pasteur tìm cách bác bỏ lý thuyết về sự sinh sản tức thời (spontaneous generation). Ông tin rằng trong không khí có các vi trùng, vì vậy ông đã nghĩ ra một cách thí nghiệm theo đó dung dịch nước đường được đun sôi và chứa trong hai bình thủy tinh khác nhau, một bình được gắn kín còn bình kia để mở ra không khí. Sau vài ngày, dung dịch trong bình thông với không khí đã bị hư hỏng, trái với dung dịch kia. Louis Pasteur cũng làm thí nghiệm với các loại dung dịch khác như sữa, nước canh… và đã chứng minh được rằng vi trùng từ bên ngoài không khí xâm nhập vào các dung dịch. Nhưng các nhà khoa học phản đối vẫn cho rằng việc gắn kín bình đã làm ngưng lại sự sinh sản tức thời. Ông Pasteur bèn nghĩ thêm một cách khác, dùng tới loại bình chứa dung dịch có cổ dài uốn theo hình chữ S nhờ đó dung dịch bên trong vẫn tiếp xúc với không khí mà không bị bụi chứa vi trung xâm nhập. Louis Pasteur còn khảo sát ảnh hưởng của không khí có chứa vi trùng tại nhiều địa điểm như trong hầm rượu, trên đồi miền Arbois và trên miền núi cao Mont Blanc. Chính vào thời kỳ ông Pasteur bận tâm khảo cứu thì người con gái đầu lòng của ông tên là Jeanne mắc bệnh sốt thương hàn và qua đời vào tháng 9 năm 1859.
Tháng 11 năm 1860, Giáo Sư Louis Pasteur báo cáo trước Hàn Lâm Viện Khoa Học Pháp về các kết quả thí nghiệm của mình theo đó, bụi trong không khí là nguyên do làm hư hỏng các dung dịch. Louis Pasteur đã nghĩ ra một phuong pháp làm sạch vi trùng mà ngày nay được gọi là cách khử trùng Pasteur (pasteurization). Nhờ phương pháp này, các thực phẩm có thể lưu trữ được lâu hơn và được chuyên chở mà không bị hư thối. Ngày 8-12-1862, Louis Pasteur được bầu vào Hàn Lâm Viện Khoa Học, một danh dự cao quý nhất của các nhà khoa học người Pháp. Các công trình nghiên cứu của ông Pasteur đã mở đường cho nhiều sinh viên và nhà khoa học khác tìm kiếm các vi trùng tại các phạm vi khác nhau.